黄家秀 秦永发 钟振国 张雯艳
（桂林医学院；广西桂林541004）
[摘要] 目的：用体外细胞培养法研究荔枝草提取物对肿瘤细胞株的生长抑制作用。方法：采用MTT法测定荔枝草提取物对宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、人肝癌细胞株BEL7404的生长抑制情况。结果：荔枝草总提取物对三种肿瘤细胞株的抑制百分率分别达到41.43％，57.84％，33.5％；95%乙醇提取物对三种肿瘤细胞株的抑制百分率分别达到33.4％，42.26％，36.07％；水提醇沉提取物对三种肿瘤细胞株的抑制百分率分别达到33.5％，46.08％，35.71％；结论：荔枝草三种提取物对3种肿瘤细胞体外增殖均有不同程度的影响，其中荔枝草总提取物体外抗肿瘤活性较强。
[关键词] 荔枝草提取物；肿瘤细胞株；MTT；抗癌活性
Effects of the Extracts from Salvia Plebeia
on the Anticancer in Vitro
Huang Jiaxiu, Qin Yongfa, Zhong Zhenguo, Zhang Wenyan
Guilin Medical College, Guilin 541004, Guangxi
[Abstract] Objective: To observe effects of extract of Salvia Plebeia on tumor cell proliferation in vitro. Methods: The growth situation was analyzed by MTT in the SGC7901,Tumor of cervix uteri Hela, Hepar carcinoma BEL-7404. Results: The inhibitive ratio of extract of Salvia Plebeia extracted by ethanol on the three tumor cells were 41.43％，57.84％，and 33.5％ respectively. Those of extract extracted by n-butanol on the three tumor cells got to 35.3％，42.26％，and 36.07％ respectively. The inhibitive ratio of extract extracted by Ethyl Acetate on the three tumor cells got to 33.5％，46.08％，and 35.71％ respectively. Conclusion: The four extract of Salvia Plebeia have different effects on the three tumor cells in vitro, inhibitive ratio of extract of Salvia Plebeia is more obvious on anti-tumor activity.
[Key Words] Salvia Plebeia; tumor cell lines; MTT; anti-tumor activity.
恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的顽疾，是人类目前最难对付的顽症之一，亦是世界医学的一大难题。给人类带来巨大的精神压力和经济负担，在我国，癌症是仅次于心血管疾病的第二类杀手[1]。随着肿瘤诊断治疗技术的不断完善，治疗水平不断提高，中医药在肿瘤治疗中的地位和综合优势愈显重要。抗肿瘤中草药的发掘和筛选已向纵深发展，近年来，从天然植物中寻找新的抗肿瘤药物已成为新药研究的主要发展方向之一。
目前临床上恶性肿瘤的化疗仍以合成药物为主[2]，但是世界上许多的科学家们逐步把研究重心移向中药方面。肿瘤的中医药治疗在我国有悠久的历史，在我国肿瘤临床上运用中医药十分普遍。1996年世界上销售量最大的七种抗癌药物就有五种是从植物或微生物代谢的天然产物中分离得到，其中从紫杉植物分离得到的紫杉醇和从Escherichia Coli细菌代谢物得到neupogen的销售额分别达8和10亿美元。广西是我国中草药资源和品种最丰富的省份之一，据民间药方和文献记载，广西一些特产及珍稀中草药具有抗癌功效，例如：荔枝草。
近年我国台湾等地的科技工作者对荔枝草主要成分及消炎、解毒、抗癌等作用做了一定的研究，《中华人民共和国药典》1977年版一部收载之[4]。对地方特产的具有抗癌活性的中草药植物，在系统的抗癌药理研究的配合下，开展有效活性成分的研究，对寻找新的抗癌药物和充分挖掘利用广西中草药资源无疑是一项非常有意义的工作。
荔枝草系唇形科鼠尾草属植物，分布于山东、江苏、安徽、广西、台湾等地，生于山坡、路旁、沟边、田野潮湿的土壤上，海拔可至2800米[5]。荔枝草全草性平、味辛、无毒；清热解毒、利尿消肿、凉血止血；主治扁桃体炎、肺结核咯血、支气管炎、腹水肿胀、肾炎水肿、崩漏、便血、血小板减少性紫癜；外用治痈肿、痔疮肿痛、乳腺炎、阴道炎[6]。现将荔枝草采用不同溶剂提取，得总提物，95%乙醇提取物，荔枝草水提醇沉物，并采用体外细胞培养的方法研究各部位的抗癌活性。
1 实验材料与仪器
1.1 样品来源
A荔枝草总提物；B荔枝草95%乙醇提取物；C荔枝草水提醇沉物。
1.2 肿瘤细胞株
宫颈癌细胞株Hela；人胃癌细胞株SGC7901；人肝癌细胞株BEL7404均购自上海细胞生物研究所细胞库。
1.3 实验试剂
四甲基噻唑蓝（MTT），德国Sigma公司产品，批号：020609
新生牛血清（FBS），杭州四季青生物工程材料有限公司产品，批号：050226
RPMI1640培养基，美国GIBCO公司产品，批号：03
胰蛋白酶（Trypsin），天津市灏洋生物制品有限公司产品，批号：200503
二甲基亚砜（DMSO），上海润捷化学试剂有限公司产品，批号：20051026
卡那霉素，德国Sigma公司分装；谷氨酰胺，Amresco分装
1.4 仪器设备
CO2培养箱（Thermo Forma），美国产，型号：381
倒置荧光显微镜（Nikon），日本产，型号：TE2000-U
倒置显微镜（Olympus），日本产，型号：CK40
酶标仪（Biocell），澳地利产，型号：Sunrise
培养瓶，美国Promega Corporation产；96孔板，丹麦产，型号：3072
微量加样器，日本产，型号：Nichipet
低压吸引器，上海医疗器械工业公司医用吸引器厂，型号：DY
2 实验方法
2.1 原理[7]
MTT是一种能接受H原子的染料。活细胞在代谢过程中，其胞内线粒体的琥珀脱氢能将可溶性的四噻唑蓝还原成不溶性的蓝紫色沉淀物甲臜（formazan），而死细胞和红细胞没有这种能力，用有机溶剂如二甲基亚砜（DMSO）溶解甲臜结晶，然后用酶标仪测定甲臜溶液光密度的OD值。相关研究表明，在细胞数从每孔200～50000个范围内，甲臜溶液OD值与活细胞数呈良好的线性关系。通过对MTT还原结果进行测定来分析细胞增殖以及药物对细胞的抑制程度。其抑制率按公式计算：抑制率%=（1-样品测定OD值/对照测定OD值）×100%[8]
2.2 MTT法
选用对数生长期贴壁肿瘤细胞，用0.25%的胰酶消化后，在96孔培养板每孔加入200μl（含5000个/ml肿瘤细胞）含10%FBS的RPMI1640培养液，37℃、10%CO2培养24h后，实验组换含新不同浓度的被测样品培养液，使其最终浓度分别为5、10、20、40、80μg/ml，对照组则加入等体积溶剂的培养液，每组设3个平行孔，37℃、10%CO2培养3d。弃上清液，每孔加入200μl新鲜配制的含0．2mg/mlMTT的无血清培养基，37℃、10%CO2继续培养4h，再弃上清液，每孔加入200μl DMSO溶解MTT甲臜沉淀，振荡均匀后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参比波长为450nm测定其OD值。重复实验3次，计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率%。
2.3 实验用液
2.3.1 药物
荔枝草提取物A、B、C分别用蒸馏水溶解后，用0．22μm微孔滤膜过滤除菌，分别用蒸馏水稀释成50、100、200、400、800μg/ml共5个浓度，放置4℃冰箱，待用。
2.3.2 MTT液
精称250 mg MTT，放入小烧杯中，加入50 ml双蒸水，振摇溶解后，用0．22μm的微孔滤器过滤除菌，分装，放置4 ℃冰箱待用。
2.3.3 RPMI1640培养液
含RPMI1640培养基(GIBCO)、3％谷氨酰胺、卡那霉素750μg/ml、10％FBS。
2.4 结果评定
结果用EXCEL软件分析数据，同一样品的不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量反应曲线，从而得样品的半数杀伤浓度。植物粗提物的IC50<20μg/ml时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作[9]。
3 实验结果
3.1 荔枝草提取物对人肝癌细胞株BEL7404的抑制结果见表1、图1。
表1 BEL7404线性回归
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4 讨论
本实验结果表明，荔枝草提取物在浓度为80μg /ml时对三种肿瘤细胞株的抑制百分率均大于30%，其中总提物达到41.43％，57.84％，33.5％，95%乙醇提取物对三种肿瘤细胞株的抑制百分率分别达到33.4％，42.26％，36.07％；水提醇沉提取物对三种肿瘤细胞株的抑制百分率分别达到33.5％，46.08％，35.71％，提示具有定的抗肿瘤作用，对于寻找新的抗肿瘤药物和荔枝草开发具有重要的意义。其体内抗肿瘤作用、抗肿瘤的具体成分和作用机制均有待进一步研究。
随着分子肿瘤学研究的不断深入，体外抗肿瘤实验已成为抗肿瘤药物研发过程中必不可少的一部分。MTT法是用来筛选抗肿瘤活性成分行之有效而又简便、快速的方法，且是美国国立肿瘤研究中心所采用的抗癌药物筛选方法，以抑制肿瘤细胞增殖为活性指标有一定特异性的药物筛选方法[10]，通过此方法，可以发现有效的抗肿瘤药物[11]。MTT法有众多优点，同时也存在一定的局限性，主要表现在标本混有正常细胞时会影响结果[12]，另外由于生成的甲臜受作用时间的影响，样品较多时测定OD值随时间而变,会增加实验误差[13]，所以严格控制加入DMSO到测定样品的间隔时间，是减少实验误差的关键之一。
目前，对肿瘤的研究、治疗速度进展仍然不尽人意，其中化疗是治疗肿瘤的主要手段之一，但其副作用及毒性大，疗效也不够理想，因此，中医中药能发挥作用成了人们的期待。国内外有关研究人员正积极寻找抗肿瘤的天然药物，业已展现出令人向往的广阔前景。抗肿瘤中草药的发掘和筛选已向纵深发展，紫杉醇等药物的研究成功，表明继续寻找有新作用机制及独特化学结构的细胞毒性药物有重要意义。
中药的抗肿瘤作用越来越得到国际社会的承认[14]。它的新进展很多，而且作用机制还有很多有待于去发现、探索。中药对抗化疗药物不良反应的临床应用和实验研究都取得了较大进展，对于提高肿瘤患者的治疗成功率及改善肿瘤病人的生存质量、延长生命方面都有显著疗效。新型的植物类抗肿瘤药对肿瘤作用机制的深入和特异性的增强能提高抗肿瘤的作用。另外，诱导肿瘤细胞凋亡及对特定化疗方案起增效作用的中草药, 以期达到在剂量减少的情况下仍能取得预期疗效的目的, 从而使化疗的不良反应进一步减轻。总之, 如何利用中医药的优势，适应新的形势需要，创制疗效更好、针对性更强的新的中药制剂，是摆在我们面前的一个新的课题。
总之，荔枝草是一个很值得进一步研究开发的药物，它具有效果好、毒副作用低的特点，而且对疾病有综合的疗效。我们相信在不久的将来，荔枝草将在临床上发挥其优势作用。
参考文献
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