广州市荔湾区环境监测站 广东广州 510000
摘要：地表水受到粪便的污染后，能够导致肠道病毒的传播与扩散，能够准确反映水体受到污染的情况的正是粪大肠菌群，因此对其快速且精确的检测是防止病毒扩散至关重要的程序。基于此，本文就水中粪大肠菌群的测定与质量控制做出了一些论述，以供相关人员参考。
关键词：粪大肠菌群；测定；质量控制
前言
属于总大肠菌群中的一部分的粪大肠菌群可以在44.5℃左右的温度之下生长的耐热菌群，从生物学来说，它属于革兰氏阴性无芽孢杆菌。其主要来源于粪便中的细菌，水中的一些病毒与粪大肠菌有着直接的关系，肠道病毒脱离了宿主的身体就不会再繁殖，可是，其在水体环境的存活能力会变得十分显著，可以达到数天甚至数个月的长时间的存活。水体一旦被粪便所污染，那么粪便中的肠道病原菌就会引起肠道传染病，更有可能引起流行病的发生。对粪大肠菌的检测与监控，能够为有关部门更有效的预报与控制疾病的流行与传播提供有力的依据。
一、水中粪大肠菌测定方法
水中的粪大肠菌的测定方法有很多，其中包括：多管发酵法、滤膜法、纸片法以及酶底物法等等。
多管发酵法
多管发酵法是将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。
滤膜法
样品通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于MFC选择性培养基上，在特定的温度（44.5℃）下培养24h，胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过呈蓝色或蓝绿色菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。
纸片法
按MPN法，将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和2，3，5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（37℃或44.5℃）培养24h，当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，产气过程相应的脱氢酶在适宜的pH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲躜（TTF），即可在产酸后的黄色背景下显示.出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有总大肠菌群或粪大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应总大肠菌群或粪大肠菌群的浓度值。
酶底物法
在特定温度下培养特定的时间，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生β-半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解为黄色的邻硝基苯酚（ONP）；大肠埃希氏菌同时又能产生β-葡萄糖醛酸酶，将选择性培养基中的4-甲基伞形酮-B-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解为4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下产生荧光.统计阳性反应出现数量，查MPN表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。
二、实验室内的质量控制
（一）对实验环境的质量控制
在做微生物监测时，对实验室环境有着较高的要求。
1.要求实验室通风良好，又能避免尘埃、过堂风和温度骤变，并保持室内空气高度清洁和实验室用具的整洁。
2.实验室空间要合理利用，把实验室分成不同的功能区域，有专供培养基制备和灭菌以及玻璃器皿和其他器具消毒灭菌用的准备室；有供分装和制备无菌培养基、转移微生物培养的无菌室；有传递间，用于传递实验分析所需的物品进入无菌室；有缓冲间，是实验人员进入无菌室前进行灭菌工作的区域。
3.无菌室应严格保持整洁，防止污染。检测工作开始前，必须用75%的酒精棉球或消毒液擦拭桌面、凳等，再开紫外线灯照射30分钟，并监测无菌室内空气的无菌状况。我们一般用沉降法测定室内空气中菌落总数，紫外线消毒后，在无菌室的四个角落、传递间、缓冲间各取监测点，分别放一个营养琼脂平板在采样点，开盖30min后盖上，于37℃培养48h，记录菌落数。其生长菌落数应≤3个/皿。
（二）实验室器材、设备的质量控制
粪大肠菌群监测用到的仪器设备温度计、天平、PH计、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱需要定期检定、校准确认后才可以使用。
实验中用到的过滤装置必须灭菌后方可使用；无菌室内的紫外灭菌灯每月用浸有乙醇的湿布擦拭一次，每月用紫外光度计测量，要求紫外灯光的紫外照度应≥70（uw/cm2），并用沉降法测定室内空气中菌落总数，其生长菌落数应≤3个/皿。或用生长有200-250 个细菌菌落的琼脂平皿暴露于紫外灯下2min，99%的菌数被杀灭，否则，即应更换新灯。
实验中用到的玻璃器皿应是硼硅玻璃制品，要求洁净不附着残渣、没有划痕和气泡。玻璃器皿试验前按无菌操作要求包扎，121℃高压蒸汽灭菌20min后方可使用。
（三）实验室用水、试剂的质量控制
1.粪大肠菌检测实验室用水的原料水要求是蒸馏水或去离子水，而且需经121℃高压蒸汽灭菌20min后方可使用。所用纯水的质量参考表1。
表1 细菌监测用纯水的质量
2.粪大肠菌群监测用到试剂均应符合国家标准的分析纯化学试剂或生物试剂。配制好的培养基要避光、干燥、5±3℃冰箱内保存，不能进行多次融化操作，以少量勤配为宜。当培养基颜色变化，或脱水明显时应废弃不用。每批培养基在使用前需经无菌检测、阳性及阴性菌株检验，符合要求后方可使用。
三、分析检验时的质量控制
（一）无菌性检验
每次检验时，要求用无菌水进行实验室空白测定，培养后的培养基上没有任何菌落生长，以此来检验实验中的培养基、滤膜、稀释水、冲洗用水、玻璃器皿和其他器具的无菌性。如检查结果显示有杂菌污染，则应剔除试验结果，重新取水样进行检验。
（二）精密度和准确度检验
精密度的检验是要求实验室分别对低浓度（地下水）、中浓度（地表水）和高浓度（生活污水）三个不同浓度细菌总数的样品进行了6次重复测定，计算实验室内的相对标准偏差，根据所得结果得出实验的精密度。粪大肠菌群的准确度检验是用标准样品进行了6次重复测定，所测得的浓度值均应在可接受范围内。
（三）培养基检验
粪大肠菌群检验时，当更换不同批次的培养基时必须使用有证标准菌进行培养基的阳性和阴性菌株检验，以检定培养基的质量。
（四）对照试验
实验室分析时，要求定期使用有证标准菌株进行阳性和阴性对照试验。
结论
实验室质量保证是对水质细菌学监测实行全面的质量管理，确保监测数据准确可靠的一项行之有效的工作程序。在进行粪大肠菌群测定时对仪器设备、试剂、用水、实验器具和环境条件，以及方法的精密度、准确度、培养基性能、空白对照、阳性及阴性对照等方法特性指标的全程质量控制，才能确保监测数据的准确性和可靠性。
参考文献：
[1]陈明桂，杨虹.酶底物法测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌质量控制研究[J].绿色科技，2020（08）：117-119.
[2]杨虹，王志强.纸片快速法测定水中粪大肠菌群质量控制研究[J].现代农业科技，2019（03）：151-152.
[3]《水和废水监测分析方法》（第四版）
[4]《水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法》（HJ 347.1-2018）
[5]《水质 粪大肠菌群的测定 多菌发酵法》（HJ 347.2-2018）
[6]《水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法》（HJ 755-2015）
[7]《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底法》（HJ 1001-2015）
2.粪大肠菌群监测用到试剂均应符合国家标准的分析纯化学试剂或生物试剂。配制好的培养基要避光、干燥、5±3℃冰箱内保存，不能进行多次融化操作，以少量勤配为宜。当培养基颜色变化，或脱水明显时应废弃不用。每批培养基在使用前需经无菌检测、阳性及阴性菌株检验，符合要求后方可使用。
三、分析检验时的质量控制
（一）无菌性检验
每次检验时，要求用无菌水进行实验室空白测定，培养后的培养基上没有任何菌落生长，以此来检验实验中的培养基、滤膜、稀释水、冲洗用水、玻璃器皿和其他器具的无菌性。如检查结果显示有杂菌污染，则应剔除试验结果，重新取水样进行检验。
（二）精密度和准确度检验
精密度的检验是要求实验室分别对低浓度（地下水）、中浓度（地表水）和高浓度（生活污水）三个不同浓度细菌总数的样品进行了6次重复测定，计算实验室内的相对标准偏差，根据所得结果得出实验的精密度。粪大肠菌群的准确度检验是用标准样品进行了6次重复测定，所测得的浓度值均应在可接受范围内。
（三）培养基检验
粪大肠菌群检验时，当更换不同批次的培养基时必须使用有证标准菌进行培养基的阳性和阴性菌株检验，以检定培养基的质量。
（四）对照试验
实验室分析时，要求定期使用有证标准菌株进行阳性和阴性对照试验。
结论
实验室质量保证是对水质细菌学监测实行全面的质量管理，确保监测数据准确可靠的一项行之有效的工作程序。在进行粪大肠菌群测定时对仪器设备、试剂、用水、实验器具和环境条件，以及方法的精密度、准确度、培养基性能、空白对照、阳性及阴性对照等方法特性指标的全程质量控制，才能确保监测数据的准确性和可靠性。
参考文献：
[1]陈明桂，杨虹.酶底物法测定水中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌质量控制研究[J].绿色科技，2020（08）：117-119.
[2]杨虹，王志强.纸片快速法测定水中粪大肠菌群质量控制研究[J].现代农业科技，2019（03）：151-152.
[3]《水和废水监测分析方法》（第四版）
[4]《水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法》（HJ 347.1-2018）
[5]《水质 粪大肠菌群的测定 多菌发酵法》（HJ 347.2-2018）
[6]《水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法》（HJ 755-2015）
[7]《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底法》（HJ 1001-2015）