吴春华
（重庆鸿翔一心堂药业有限公司 重庆 401121）
摘要：目的：建立三七粉中控制菌（大肠埃希菌）质量控制方法。方法：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液，取上供试液10ml，加入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，接入100ml胰酪大豆液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时，同时做阳性对照试验、供试品对照组和阴性对照试验。结果：控制菌（大肠埃希菌）检查用培养基及检测方法的适用性符合要求，加菌试验组和阳性对照组均能有效检出大肠埃希菌，供试品对照组和阴性对照均未检出。结论：该检测方法可行，能有效控制产品的大肠埃希菌。
关键词：三七粉；大肠埃希菌。
一心堂药业生产的三七粉采用云南文山地道三七为原料，药材经辐照或热压灭菌后，粉碎成的超微细粉供服用，具有止血化瘀、免疫调节、预防心脑血管疾病、降压降脂、增强记忆、美容养颜等功效。在生产过程中，药材灭菌不彻底、生产环境污染可能导致大肠埃希菌的侵入，引起腹泻、腹痛、恶心、低热等，严重时可发展为溶血性尿毒综合征和血栓性血小板减少性紫癜等多器官损害。老人和儿童患者死亡率很高。因此控制产品中的大肠埃希菌非常重要，现就我公司生产的三七粉的大肠埃希菌测定如下：
1 仪器与试药
CSH-222J-生化培养箱（重庆创测科技有限公司），LDZX-75KBS-立式压力蒸汽灭菌器（上海申安科学仪器有限公司）；枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501、金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003、铜绿假单胞菌CMCC（B）10 104、白色念珠菌CMCC (F) 98 001、 黑曲霉CMCC(F)98 003、大肠埃希氏菌标准菌株CMCC(B)44103均来自中国药品生物制品检定研究院；沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯琼脂培养基、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液均来自北京路桥技术有限公司；三七粉（规格：250g，批号：20200907、20200912、20200916，云南鸿翔一心堂药业有限公司）。
2 方法与结果
2.1控制菌（大肠埃希菌）的检查菌液的制备：取新鲜的大肠埃希菌的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml不大于100cfu的菌悬液。
2.2 大肠埃希菌检查用培养基的适用性检查
（1）促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，与对照培养基管比较，结果：被检培养基试验菌应生长良好。
（2）抑制能力检查：接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，结果：与对照培养基管比较，试验菌应不得生长。
（3）指示特性检查：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于麦康凯琼脂培养基和对照培养基平板上，在30～35℃培养18～24小时，结果：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等与对照培养基一致。
2.3大肠埃希菌检查方法适用性试验
（1）加菌试验组：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液，取供试液10ml，加入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，接入100ml胰酪大豆液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
（2）阳性对照试验：取不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，加入pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100ml中，混匀，于30～35℃培养18～24小时。
（3）供试品对照组：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液，取上清液10ml，接入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，接入100ml胰酪大豆液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
（4）阴性对照试验：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，接入100ml胰酪大豆液体培养基中，混匀，于30～35℃培养18～24小时。
（5）选择和分离培养：分别取上述培养物1ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72小时。
（6）结果判断：若上述试验组检出试验菌，按此供液试液制备方法和大肠埃希菌检查进行供试品的控制菌检查，阳性对照试验组应有菌生长，阴性对照试验组应无菌生长，若未检出试验菌，应采用其它方法消除供试品的抑菌性，并重新进行方法适用性试验。分别进行3次独立的平行试验。结果：大肠埃希菌检查方法的验证结果显示加菌实验组和阳性对照组控制菌均生长良好，供试品对照组和阴性对照组均未检出。
2.5三七粉大肠埃希菌的检测
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液，取上供试液10ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72小时。若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离，纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌，若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。对连续生产的自制品（批号：20200907、20200912、20090916）样品进行检查，检测结果见表1。
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讨论：在检测过程中，均按照《中国药典》2015年版四部常规法进行试验，其方法的判断结果准确，我公司连续3批生产样品均未检出大肠埃希菌，说明车间质控严格，未带入致病菌，产品质量可靠。
*通讯作者：执业药师，质量总监，研究方向：质量管理， 邮箱：54489773@qq.com