黄柳
乐信乐美（海南）生物科技有限公司，海南海口 570311
摘 要：为建立高效液相色谱法测定熊去氧胆酸片含量的方法，采用示差折光检测器，流动相为甲醇-水-磷酸（82：18：1）的体系，柱温40℃；流速1.0ml/min，进样量10μl。结果表明，熊去氧胆酸在浓度为1.88～5.62mg/ml的范围内，线性关系良好，平均回收率为100.16%，RSD值为0.39%（n=9），定量限为56.20ng。该方法准确、可靠，适用于熊去氧胆酸片含量测定。
关键字：高效液相色谱法；熊去氧胆酸；含量测定
Determination of the content of ursodeoxycholic acid tablets by HPLC
Huang Liu
Lucktin (HaiNan) Biotech Co.,Lcd,HaiKou,570311,China
Abstract:In order to establish a high performance liquid chromatography method to determine the content of ursodeoxycholic acid tablets, a Refractive Index detector was used, the mobile phase was a methanol-water-phosphoric acid (82:18:1) system, the column temperature was 40℃, and the flow rate was 1.0ml/min, the injection volume is 10μl. The results showed that ursodeoxycholic acid had a good linear relationship in the concentration range of 1.88~5.62mg/ml,the average recovery rate was 100.16%, the RSD value was 0.39% (n=9), and the LOQ was 56.20ng. The method is accurate, reliable, and suitable for the determination of ursodeoxycholic acid tablets.
熊去氧胆酸是从中药熊胆中分离的活性成分之一，为胆甾酸类化合物，即3α,7β-二羟基-5β胆烷酸[1]。1927年首次从熊胆汁中分离得到纯结晶，1957年合成成功并开始作为利胆剂用于临床。熊去氧胆酸片由日本田边三菱制药株式会社于1962年7月在日本首家批准上市。主要用于胆固醇型胆结石，形成胆并缺乏性脂肪泻，也可用于预防药物性结石形成及治疗脂肪痢(回肠切除术后)。
熊去氧胆酸片目前在现行版中国药典[2]、美国药典[3]、日本药典[4]均有收载。本文旨在建立高效液相色谱法测定熊去氧胆酸片含量的方法，为熊去氧胆酸片含量质量控制提供科学依据。
1.仪器与材料
LC-2030高效液相色谱仪（日本岛津），RID-20A示差折光检测器（日本岛津），甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为国产分析纯。所有对照品均来源于中国食品药品检定研究院，熊去氧胆酸（批号：110755-201704），羟苯丙酯（批号：100444-201804），熊去氧胆酸片（本公司自制，批号：200901、200902、200903）。
2.方法与结果
2.1色谱条件
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇-水-磷酸（82：18：1）；柱温为40℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl。上述色谱条件下，熊去氧胆酸保留时间约为8min，熊去氧胆酸峰与羟苯丙酯峰的分离度应不小于3.0，理论塔板数按熊去氧胆酸峰计算应不低于1600，拖尾因子应不大于2.0。
2.2内标溶液的配制
取羟苯丙酯约37.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加80%甲醇溶液适量，超声使溶解，冷却至室温，用80%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3对照品溶液的配制
取熊去氧胆酸对照品约37.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液适量，超声使溶解，冷却至室温，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4供试品溶液的配制
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于熊去氧胆酸37.5mg)，置10ml量瓶中，加内标溶液适量，超声15分钟，冷却至室温，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.5样品测定
精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算熊去氧胆酸片的含量。结果200901批、200902批、200903批三批样品的含量分别为98.2%、98.5%、99.3%。
3.方法学验证
3.1专属性试验
配制熊去氧胆酸片中的空白辅料溶液、对照品溶液和供试品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定。结果表明，空白溶剂及空白辅料对本品含量测定均无干扰，供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间一致。
3.2定量限试验
取熊去氧胆酸对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加80%甲醇溶液适量，超声使溶解，冷却至室温，用80%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。逐级稀释储备液至测定结果信噪比约为10。取对照品储备液平行配制6份。结果显示，熊去氧胆酸定量限为56.20ng，定量限溶液连续进样6针的峰面积和保留时间的RSD分别为4.44%和0.06%，定量限精密度良好，能满足本品定量测定要求。
3.3线性试验
精密称取熊去氧胆酸对照品适量，加80%甲醇溶液溶解制成7.5mg/ml的对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适量，加80%甲醇溶液稀释制成浓度为1.88mg/ml、2.81mg/ml、3.75mg/ml、4.50mg/ml、5.62mg/ml的系列溶液。结果表明，经线性回归分析，在浓度为1.88～5.62mg/ml的范围内，浓度与峰响应值呈线性关系。线性回归方程为y=56393x+17111，相关系数r为1.0000，Y轴截距为0.31%。线性关系良好。
3.4准确度试验
按工作浓度的80%、100%、120%，精密称取熊去氧胆酸对照品各三份，分别置10ml量瓶中，加入处方量的辅料，混匀，加内标溶液适量，超声15分钟，冷却至室温，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，每个浓度平行配制3份溶液。精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算测得量，按测得量与实际加入量（称样量*对照品含量）的比值计算回收率。结果表明，每个浓度平均回收率均在98%～101%之间，平均回收率为100.16%，RSD为0.39%，本品回收率良好。
3.5溶液稳定性
取供试品溶液和对照品溶液，室温条件下放置，分别于0、2、4、6、8、12、24、36、48小时取样测定。精密量取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图，计算主峰面积的RSD值。结果表明，供试品溶液和对照品溶液在室温条件下放置48小时，溶液稳定性良好。
3.6仪器精密度试验
配制一份对照品溶液，精密量取对照品溶液10μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图，重复进样6次，计算峰面积的RSD值。结果表明，6份对照品溶液的主峰面积RSD为0.09%（≤2.0%），保留时间RSD为0.01%（≤1.0%），仪器精密度良好，能满足本品含量测定要求。
3.7重复性试验
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于熊去氧胆酸37.5mg)，置10ml量瓶中，加内标溶液适量，超声15分钟，冷却至室温，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。平行配制6份溶液。结果表明，6份样品平均含量为98.48%，RSD为0.23%，表明本方法重复性良好。
3.8中间精密度试验
另一实验员，在不同的检查日期，采用不同的分析仪器，按照“3.7重复性试验”项下方法测定。结果表明，12份样品的平均含量为98.98%，RSD值为0.46%，表明本品含量测定方法的中间精密度良好。
4.结论
本方法采用示差折光检测器，可用于检测在紫外光范围内吸光度不高的化合物。所建立的熊去氧胆酸片含量测定方法稳定性好，操作简便、快速，为熊去氧胆酸片质量控制提供了一种可靠的方法。
参考文献：
[1]彭波,朱华艳.RP-HPLC测定熊去氧胆酸片中熊去氧胆酸含量及有关物质[J].医药前沿,2017,7(1):374-375.
[2]中国药典[S].2020年版.二部.2020:1789.
[3]美国药典[S].USP41版.4259-4260.
[4]日本药典[S].JP17版.1750-1751.