徐颖
哈药集团三精制药有限公司 黑龙江省哈尔滨市 150069
摘要：高效液相色谱是广泛应用的分析手段之一,它不仅能分离复杂成分的混合物,而且能同时提供定性定量数据。本文探讨了高效液相色谱用硅胶键合固定相的研究进展。
关键词：高效液相色谱；硅胶键合固定相；进展
随着以人类健康、生物工程为核心的生命科学、环境科学及制药、合成化学的迅猛发展,高效液相色谱(HPLC)以其高效、温和、应用范围广等优点而备受人们关注。色谱柱填料是色谱仪的“核心”，不仅能反映色谱方法的水平,而且是一个量大面广的消耗品。因此,高效液相色谱柱填料方面的研究一直十分活跃。这一领域虽已开发了多种色谱填料,如有机高分子、石墨化碳及无机氧化物等材料,但硅胶作为柱填料仍具有不可替代的地位。
一、针对分离物设计制备的硅胶键合固定相
自1990年有学者找到制备克量级C60的方法以来,如何合成具有特定功能的C60衍生物,并探索它们在不同领域的独特应用,成为化学家们角逐的热点。对富勒烯复杂混合物的分离,需要合适的固定相。体积排阻色谱法及经适当改性的硅胶柱在该方面得到了很好的应用。后者一般在硅胶表面引入取代芳香烃、酞菁或四苯基卟啉类基团,其基本指导思想是使固定相上引入的芳香烃部分与富勒烯笼反应,产生有效的相互作用,以形成超分子复合物；超分子复合物的稳定性决定了分离程度,而稳定性亦受到芳香环电性能及空间排布的极大影响。与此相反的另一种途径是采用富勒烯改性硅胶作HPLC色谱柱填料对富勒烯进行分离。C60具有独特的球形三维π电子共轭体系及良好的热稳定性,其衍生物在色谱领域,特别是在HPLC中已有一些应用。这不仅是高效分离富勒烯的一种方法；同时,由于色谱对分离物结构、形状、尺寸及动力学微小的变化反应敏感,又成为研究富勒烯与溶剂之间超分子间作用力的一个有效途径。
有学者合成了C60(H)CH2SiCl(CH3)2等类型的键合硅胶液相色谱固定相,并考察了该类固定相对多环芳烃、富勒烯和杯芳烃的分离效果；并以γ-(乙二氨基)丙基三乙氧基硅烷为偶联剂,合成了C60键合的硅胶键合固定相,并用于多环芳烃和杯芳烃的分离；同时测定卟啉键合相对C60、C70、氨基酸、多环化合物的色谱性能。
随着人们对手性现象的认识和不对称合成的发展,用以拆分对映体的各种手性固定相不断涌现,被广泛用于药物、生物及不对称合成领域。在HPLC中应用的硅胶键合手性固定相一般有冠醚类、抗菌素类、环糊精类、蛋白质类、多糖衍生物类、氨基酸及其衍生物类等。
还有学者制备了一系列环糊精、冠醚等结构功能团的硅胶键合手性固定相,这些固定相对某些对映异构体及氨基酸结构异构体具有良好的选择性。此外，还考察选择甲基化β-环糊精(2，3-单甲基化和2,3-双甲基化)对单、双、叁氯苯的HPLC分离性,并首次合成出选择甲基化γ-环糊精硅胶键合固定相,评价了该类固定相对对映体的识别能力。结果显示,通过控制流动相的组成,γ-环糊精能对丹酰氨基酸对映异构体提供有效、选择性的分离；流动相中甲醇含量降低,容量因子和拆析能力显著提高；γ-环糊精的2位羟基对丹酰氨基酸对映体的识别过程是不可缺少的。
此外，还将纯对映体(二苯-取代1,1′-联苯)冠醚键合至5μm硅胶上,从而制得新型手性固定相。将其用于分离各种天然与非天然α-氨基酸的对映异构体,除脯氨酸外(不含伯氨基),所有的α-氨基酸均得以很好的分离。同时,发现α-氨基酸在新固定相上的拆析与有机及酸性改良剂的种类与数量有关,与柱温也有关。将α-糜蛋白酶固定于环氧化的硅胶上,原位制备了糜蛋白酶键合硅胶手性固定相,并用于分离氨基酸酯。
有学者合成了6-乙烯基纤维素氨基甲酸苯酯衍生物,将其与少量苯乙烯通过自由基共聚而有效固定于硅胶上。
所得手性固定相的手性识别能力与那些将手性固定相涂敷于硅胶上的固定相类似；其目的在于解决四氢呋喃、氯仿此类溶剂因会溶解或溶胀聚糖类物质而不能加到流动相中去的这一缺陷。
二、对传统固定相的改进
反相键合固定相是一类应用最广泛的固定相。含烷基、苯基、酚基、醚基等非极性或弱极性基团的固定相,其色谱分离方式一般为反相模式。在HPLC中,C18、C8烷基键合反相硅胶固定相应用颇多,是一类成熟的固定相。
有学者采用硅烷偶联剂制备出含C8～C13混合型烷基键合硅胶液相色谱固定相,多环芳烃在混合烷基键合硅胶固定相上的分离略好于Zo rbax ODS柱,二者出峰顺序相同。同时，研究了C18HPLC的耐纯水流动相的稳定性,将置于该流动相环境中的反相键合相保留值的损失归因于固定相烷基链的折叠,并将HPLC用C18柱依折叠程度分为易折叠型、抗折叠型和不折叠型等,并认为将柱置于不流动的纯水流动相中,是检测其链折叠敏感度快捷方便的手段。
在不同色谱柱上富/贫芳香基团分离物的保留行为受分离物与固定相间π-π作用的影响而不同。被分析物的保留时间随憎水性的增加而增加。因而制备了支化聚氟烷基硅烷硅胶,研究了支化聚氟烷基硅烷与硅胶的反应条件,评价了它的HPLC分离特性。
对于正相键合固定相,用一种Ni(Ⅱ)-酞菁衍生物改性氨丙基硅胶,评价它作为HPLC用固定相分离富π电子化合物(如聚芳香烃类化合物)的效果。针对该类固定相对富π电子化合物的保留值大于Cu(Ⅱ)的同类固定相这一现象,这预示着含Ni(Ⅱ)固定相与被分离物间除π-π作用外,还有一种附加的作用力。
HPLC在一般情况下只可分离类型单一的物质,如非极性有机物或无机离子。同时对几类物质进行分离并非易事,往往需采用两个或多个柱子,或在一根柱子上设计匹配的固定相-流动相,以利于色谱相对不同被分析物的传输。
另外，采用一个8-羟基喹啉硅胶柱与一个商品化的C8/离子交换硅胶柱对无机离子中性有机物(极性的聚核芳香化合物)同时进行分离；采用商品化C8/弱酸硅胶柱与苯磺酸强酸硅胶柱分离金属阳离子/中性有机混合物。
硅胶键合固定相虽然有很多优点,但也存在弱势。硅胶键合固定相表面的Si-O-Si-C链耐碱性能差；另外,因表面硅羟基残余量较大,造成残余吸附和色谱峰拖尾现象。国内外色谱化学工作者在硅胶键合固定相性能改进方面,已做了大量有意义的工作。
此外，使用一系列低pKa及高pKa值的碱性化合物,评价传统C18固定相、具有内嵌极性基团固定相、短链固定相、氰固定相和耐强碱固定相等反相柱填料的性能,其目的在于确定这些彼此不同的固定相在对碱性化合物进行分析时,与C18固定相相比,是否具有一些优势；并研究缓冲或未缓冲、经甲醇或乙腈改性的流动相。内嵌极性基团固定相与传统C18固定相相比,憎水性降低、选择性略有不同、对碱性物质的惰性更大；短烷基链固定相可改进碱性物的峰形,而选择性在pH值为7.0时,虽与烷基链相似,却与氰丙基固定相截然不同。
有学者合成了硅醚型硅烷中间体,将其与硅胶进行键合,在不进行封尾的条件下,得到了键合均匀、键合量较高的HPLC填料。并采用γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷作偶联剂,制备了十八烷基酯键合及醚键合反相固定相。同时，采用硅烷偶联剂β-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷与辛醇反应,再键合至硅胶上,得到了醚型键合固定相。以上均是国内针对碱性化合物的分离分
析对硅胶键合固定相而展开的研制工作,取得了良好效果。
三、展望
硅胶键合固定相在HPLC领域应用十分广泛。提高固定相的耐碱性、使用寿命和使用稳定性,在微观角度上进行分子设计,从而赋予固定相更高的分离效能,以及随着药物合成、生物工程及相关领域的发展,会对HPLC不断提出更高、更新的要求。这些都使得对硅胶键合固定相的研制变得富有趣味性和挑战性。随着研究的深入和性能的完善,硅胶键合固定相将以其独特的优势和丰富的品种在HPLC及其它色谱领域继续发挥重要作用。
参考文献：
[1]于世林.高效液相色谱法[M].北京:化学工业出版社,2015.
[2]冯钰琦.C60键合硅胶液相色谱固定相的合成及其性能评价[].色谱,2015(02).