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离子色谱-电导检测法测定酪蛋白粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量

发表时间：2021/3/16 来源：《中国科技信息》2021年2月作者：陈思思

[导读] 本文建立了酪蛋白中NO2-和NO3-测定的离子色谱-电导检测法的回收率优化分析方法。水相超声提取蛋白粉中亚硝酸盐和硝酸盐，以氢氧化钠溶液作为流动相，AS19柱分离，电导检测器检测，根据保留时间定性，外标法准确定量。样品经蛋白酶酶解处理，水相超声提取后，依次除去提取液中的有机物质和可能产生干扰的氯离子，上机测定。

中检科（上海）测试技术有限公司陈思思

摘要：本文建立了酪蛋白中NO2-和NO3-测定的离子色谱-电导检测法的回收率优化分析方法。水相超声提取蛋白粉中亚硝酸盐和硝酸盐，以氢氧化钠溶液作为流动相，AS19柱分离，电导检测器检测，根据保留时间定性，外标法准确定量。样品经蛋白酶酶解处理，水相超声提取后，依次除去提取液中的有机物质和可能产生干扰的氯离子，上机测定。在0.01~0.50mg/L、0.02~1.00mg/L范围内成线性，相关系数分别为：0.9990和0.9992，检出限以NaNO2计和NaNO3计分别为:0.3mg/kg、0.55mg/kg，回收率达到88.5％~105％。此法满足相关标准中对食品中NO2-和NO3-含量测定的技术要求,可用于蛋白粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量测定。
关键词：离子色谱；电导检测器; IonPacAS19；氢氧化钠；酪蛋白粉；蛋白酶；回收率
        引言：在一些特殊细菌的作用下NO3-被还原成NO2-，人体中血红蛋白在其作用下被氧化成为高铁血红蛋白，使血红蛋白失去其在体内输送氧的能力，出现组织缺氧等症状。另一方面，在酸性条件下，PH值较低时，也有利于NO2-与次级胺结合反应生成亚硝胺类物质，其致癌机理即为：在胃酸等环境下的NO2-与食物中的次级胺等反应生成强致癌物N-亚硝胺，亚硝胺还可以通过胚盘进入胎儿体内，可致其畸形。因此，控制食品中NO2-、NO3-的含量对人民群众的生命健康有着重大意义，而蛋白粉（一般采用提纯的大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、豌豆蛋白等蛋白或以上几种蛋白复合加工制成的富含蛋白质的粉末）作为健身人士及特殊人群常见的蛋白质补充剂，对其进行NO2-和NO3-含量的监控极具意义。
        一、实验部分
        1.1仪器：
        1.1.1离子色谱仪：ICS-5000+（配电导检测器）
        1.1.2电子天平：感量为1mg，AsitoriusQuintix 65-1CN
        1.1.3超声清洗仪:KQ-800DE
        1.1.4水浴振荡器：赛得利斯SHA-C
        1.1.5高速离心机:湘仪H1850
        1.1.6涡旋混合器：DNB,MX-S
        1.1.7移液枪：research plus 20μL，200μL，1000μL
        1.2试剂耗材：
        1.2.1 亚硝酸盐和硝酸盐有证书标准品（1000mg/L）
        1.2.2 氢氧化钠试剂（50％，质量百分比）
        1.2.3 6％冰乙酸（AR）:取6mL冰乙酸高纯水定容至100mL，混合均匀。
        1.2.4 Dionex OnGuardTMII RP柱、H柱和Ag柱
        1.2.5 0.2μm水性滤膜
        1.2.6 2.5mL注射器
        1.2.7 蛋白酶（最适酶解温度50℃）
        1.3色谱条件：
        1.3.1色谱柱：IonPac AS19分析柱(4 x 250 mm) ，配AG19保护柱(4 x 50 mm)   柱温：30℃
        1.3.2抑制器：DionesADRS 600-4mm
        1.3.3 进样环：50μL
        1.3.4流速：1mL/min
        检测器：电导检测器，检测池温度35℃
        1.4 淋洗液配置：
        1.4.1淋洗液A: 高纯水，过0.2μm过滤膜
        1.4.2淋洗液B: 取2.5mL50％（w/w）氢氧化钠溶液，加入1L超纯水中，超声40分钟，过0.2μm过滤膜?
        14.3淋洗液C: 取5.0mL50％（w/w）氢氧化钠溶液，加入1L超纯水中，超声40分钟，过0.2μm过滤膜?
        1.5淋洗梯度：
        淋洗液A：高纯水
        淋洗液B：50 mM氢氧化钠
        淋洗液C：100 mM氢氧化钠

1.6标准曲线配制：
移液枪分别移取亚硝酸盐、硝酸盐标准溶液0.25mL、0.50mL于50mL容量瓶中高纯水定容摇匀，制得亚硝酸盐、硝酸盐含量分别为5μg/mL、10μg/mL的混合标准溶液，分别移取混合标准溶液梯度体积至10mL容量瓶，定容摇匀。配置标准曲线梯度如下表：

         得到标准曲线的线性方程和相关系数分别为：
        亚硝酸盐线性：y=0.496x-0.004，R=0.9990，硝酸盐线性：y=0.364x+0.006，R=0.9992；
        1.7实验处理过程：
        1.7.1无酶解的样品前处理：准确称取2.500g酪蛋白粉作为试样于50mL离心管中，加标后，加入0.2g蛋白酶并30mL超纯水溶解混合均匀，于50℃水浴锅酶解30min，样品冷却后，超声提取20min，加入6％的冰乙酸0.5mL，在4℃冰箱20min沉降蛋白后,定容摇匀，7000r/min离心8min，取上清液依此通过RP柱、H柱、Ag柱(可根据实际样品情况，选择使用什么类型的前处理小柱)和0.2μm滤膜，上机测试。
        1.7.2酶解的样品前处理：准确称取2.5000g酪蛋白粉作为试样于50mL离心管中，加标后，加入30mL超纯水溶解混合均匀，超声提取20min，加入6％的冰乙酸0.5mL，在4℃冰箱20min沉降蛋白后,定容摇匀，7000r/min离心8min，取上清液依此通过RP柱、H柱、Ag柱(可根据实际样品情况，选择使用什么类型的前处理小柱)和0.22μm滤膜，上机测试。
        二、数据处理及回收率比较：
        表1是酶解前，酪蛋白样品中亚硝酸盐和硝酸盐加标回收数据数据处理
        表2是酶解后，酪蛋白样品中亚硝酸盐和硝酸盐加标回收数据数据处理
        表3是酶解前后，酪蛋白样品中亚硝酸盐和硝酸盐加标回收率数据比较
        图1、图2、图3分别为无酶解的酪蛋白样品、1倍加标样品，2倍加标样品萃取液中亚硝酸盐和硝酸盐的色谱分离图；图4、图5、图6分别为酶解后的酪蛋白样品、1倍加标样品，2倍加标样品萃取液中亚硝酸盐和硝酸盐的色谱分离图。

三、精密度
随机抽取市面上常见的3种蛋白粉，经酶解处理上机，所得样品目标物质（NO2-、NO3-）的峰面积和保留时间的RSD值，数据如表4。

       四、实验结论：
       4.1 标准曲线、检出限：
       NO2-和NO3-的线性变化范围分别为：0.01~0.50μg/mL、0.02~1.00μg/mL，相关系数分别为：R=0.9990、R=0.9992；由0.01μg/mL亚硝酸根和0.02μg/mL硝酸根图谱，得到信噪比（S/N）≥3，当称取的样品质量为2.5g，定容体积为50mL时，可得检出限分别为0.3mg/kg（以亚硝酸钠计）、0.55mg/kg（以硝酸钠计），达到国标要求。
        4.2回收率比较：
        酪蛋白酶解前亚硝酸盐和硝酸盐含量分别为：0、9.08mg/kg，酶解后为：0，10.4mg/kg，加标回收率从61.0％～73.5％，提高到88.5％～105％，可以看出：对蛋白粉及蛋白粉类物质（酪蛋白）中亚硝酸盐和硝酸盐测定，使用蛋白酶酶解处理后，能够有效提高样品检出值和加标回收率，使实验结果更具说服力。
注：酶解过后对样品在通过前处理小柱和滤膜时更容易推出，大大提高工作效率。
        4.3精密度：
        6种类型蛋白粉，经酶解处理上机，得到亚硝酸根和硝酸根峰面积和保留时间的相对标准偏差在1.9％～2.1％之间，验证得出结论：对大多数蛋白粉及蛋白粉类物质来说，经酶解处理的样品测试结果是可行的。
       注意事项：
        1、样品酶解温度要根据所用蛋白酶所使用的具体蛋白酶最适酶解温度设定，可大大提高酶解效率，提高硝酸根和亚硝酸根含量加标回收率；
        2、0.5mL6％冰乙酸沉降是最适浓度，沉降用的冰乙酸含量加入过低沉降效果不明显，加入过高时NO2-检出量降低，加标回收率也会有一定程度的降低；
        3、上机检测时，保证样品中氯离子含量小于400mg/L，氯离子含量也可通过离子色谱定量得到，稀释上机或者过Ag-H柱根据具体情况均可达到降低上机检测氯离子含量的效果，否则NO2-提前会出峰，与氯离子检测峰分离困难，导致定量不准确；
        4、样品处理液需在24h内上机测试完成，否则亚硝酸盐和硝酸盐可能会发生10％左右的含量改变。
参考文献：
[1]GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范
[2]GB/T 27417-2017 合格评定化学分析方法确认和验证指南
[3]GB 2762-2017 食品安全国家标准食品中污染物限量
[4]中国疾病预防控制中心营养与食品安全所.GB 5009.33-2016 食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[S].中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
[5]SN/T 5120-2019 进出口食用动物、饲料中亚硝酸盐测定比色法和离子色谱法
[6]李良，王晴，江勇.离子色谱法同时测定乳粉中亚硝酸根、硝酸根、氯离子和磷酸根[J].理化检测-化学分册，2007，43（10）：835-837