黑龙江八一农垦大学 郜晓虹 何孝星 163319
摘要：现如今，我国的科技在不断发展，社会在不断进步，实验室条件下可培养的微生物约占自然界中微生物总数的１％，这限制了人们对９９％未知微生物的认识和利用，而研究表明，那些“不可培养的微生物”是可以被开发和利用的，未能被纯培养的微生物才是未知微生物的主体。微生物培养组学探索利用多种培养条件和长时间的培养，结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）和１６Ｓ核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）测序可以大规模鉴定各种微生物，同时利用全基因组测序和宏基因组测序手段对未知微生物进行深入分析。本文综述了国内外近年来微生物菌群培养组学在反刍动物胃肠道、禽类盲肠及家畜鼻腔微生物菌群研究中的最新进展，探讨将动物体内菌群培养组学方法应用于动物疾病防治领域的可行性。作为一个新兴的研究方法，尽管该培养组学还存在一些不够成熟的方面，但它的发展前景十分广阔，微生物菌群培养组学方法和其他研究方法的互补已经逐渐成为发展兽医微生物学新的突破口。
关键词：培养组学；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ；１６ＳｒＲＮＡ；基因组测序；瘤胃微生物区系；盲肠微生物群
引言
遗传学在动物生长和存活性状中起着重要的作用，这并不是什么新的观点；但是，肠道微生物菌群的遗传组成及其对上述性状的影响却很少能成为人们的理论和研究方向。它的影响可能被低估了。直到最近，人们仍极难获得肠道微生物菌群组成的详细信息。但是，自基因组测序价格下调后，肠道微生物菌群的遗传学越来越多地受到研究人员的关注。这项技术最终能否帮助我们在不远的将来揭示肠道微生物菌群影响动物健康的秘密？我们已经知道，在很多情况下肠道微生物菌群对动物的健康有一定的影响。因此，如果我们能对肠道微生物菌群的本质了解得更多一些，很多问题就都能找到答案。
1动物肠道微生物的组成
动物包括人类在内，其消化道内存在多种类型的微生物，包括细菌、古菌、真菌、病毒和寄生虫等，这些微生物及其代谢产物在营养、免疫等方面对宿主的健康有重要的意义。消化道内细菌在数量上占绝对优势，且主要是厌氧细菌。研究人员多通过采用16SrＲNA基因测序，对细菌进行种属鉴定。GenBank里登录有超过20万种动物细菌16SrＲNA基因序列，能确定种属的细菌有1822种，其中不可培养的有1689种。研究表明，整个消化道内均存在微生物，且不同肠段微生物组成存在差异。在胃和小肠内，主要以梭菌IX群、链球菌和乳杆菌等为优势菌群，每克消化道内容物内细菌的数量为10－107;盲肠微生物多样性较高，以厚壁菌门中的梭菌IV群和梭菌XIV群和拟杆菌门为最优势菌群，细菌数量为1012－1013/克内容物;自结肠到直肠，微生物的优势菌群仍为拟杆菌门和厚壁菌门。本实验室多年来一直从事消化道微生物的研究，着重研究了猪和小鼠等动物以及牛、羊等反刍动物的胃肠道微生物的组成及影响因素。大量研究表明肠道微生物菌群受到许多因素的影响，包括亲缘关系、日粮组成、日龄、生活环境和应激等。
2.微生物菌群培养组学在动物医学中的应用
2.1益生素
益生素(Probiotics)是一类通过促进肠道微生物平衡,对宿主动物产生有益影响的活的微生物饲料添加剂,最早应用于陆生动物。益生素通过产生抑菌物质,如细菌素、类细菌素达到抑菌作用;益生素粘附在胃肠道粘膜上皮细胞,形成保护性生物膜,有效减少病原菌的定位转移、日粮和粘膜抗原经肠道的转移,避免局部炎症或者是自身免疫感染性疾病的发生,从而促进肠道的修复;另外,益生素有提高机体免疫机能、促进机体营养吸收等作用。研究表明,乳酸菌、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母菌等均可作为益生素调控胃肠道微生物的组成。益生素产品在调控仔猪腹泻疾病中效果较好,但到目前为止,对益生素的研究绝大多数还在使用效果上,对其作用机理研究还不够。专门化和序列化菌种的研制生产,研究益生素对胃肠道菌群的定性、定量和定位的作用机理,对针对性更好的菌种的寻找十分有益。总之,益生素作为一种天然绿色饲料添加剂,没有抗生素的副作用,今后在畜牧业上的应用将更加广泛。
2.2纤维的正确饲喂时间和被利用的正确部位
动物后肠的发育在其生命的早期并不完善。动物生长得越成熟，它就越容易从饲料中的各种纤维源上获益。粗纤维源已成为猪日粮的一部分，猪的进化已帮助其能够存活并从这类日粮成分中受益。猪年龄越小，其从这些纤维源成分中获益的先天能力就越弱。为了能使动物从这类饲料原料中充分获益，确保这些成分到达大肠的正确部位十分重要。许多益生类饲料成分很可能在消化道中被过早地消化而不能抵达大肠，从而无法发挥其最大的有益作用。
2.3对猪鼻腔微生物群可培养菌株的体外重建以及细菌鉴定技术
采集健康猪的鼻腔和鼻部表面的拭子样本，将拭子在９ｇ·Ｌ－１盐水中混匀，并制备１∶１０、１∶１００和１∶１ ０００稀释液。向含５ｇ·Ｌ－１绵羊血的哥伦比亚琼脂平板、巧克力琼脂平板、哥伦比亚ＣＡＰ琼脂平板和麦康凯琼脂平板中分别接种各个稀释液１００μＬ，有氧培养２４ｈ（巧克力琼脂，５０ｍＬ·Ｌ－１ＣＯ２）。Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ琼脂平板、添加卡那霉素／万古霉素的Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ琼脂平板、巧克力琼脂和哥伦比亚ＣＡＰ琼脂平板分别接种等量的样品进行厌氧培养，分别培养４８ｈ后取单个菌落。首先用ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ进行初步分类鉴定，当鉴定得分＞２．０分可以视为对菌株在种的水平上精确鉴定，随后对未能通过质谱鉴定的细菌，使用１６ＳｒＲＮＡ进行下一步鉴定。当分离株与ＮＣＢＩ和ＲＤＰ数据库中系统发育最接近的模式种的序列相似性＜９８．７％时，则被认为代表该属内新种；当分离株与ＮＣＢＩ和ＲＤＰ数据库中系统发育最接近的模式种的序列相似性＜９５％时，被认为该科内新属。
结语
虽然动物肠道微生态的研究成为当前一个前沿领域,关于胃肠道微生态区系及其调控技术的研究还较薄弱,这也间接导致了生产中益生素和化学益生素等的使用效果不稳定,限制了其在猪禽养殖中的应用。因此,加强动物肠道微生物组成和结构的研究,在指导高效益生素、化学益生素、微生态制剂、中草药的开发和应用,促进我国畜禽养殖业的同时,还有助于根本上解决养殖行业中抗生素和其他化学药物的长期大量使用所带来的负面效应,具有重要而深远的意义。
参考文献
[1]苏勇，谢飞，朱伟云．健康与腹泻仔猪粪样中挥发性脂肪酸和菌群区系的比较．微生物学报，2011，51(12):1632-1638．
［2］汤飞飞．母猪妊娠后期和仔猪日粮添加酵母培养物对母猪生产性能、仔猪肠道健康及免疫机能的影响．南京农业大学学位论文，2012．