李航 王梦英 吴洋
浙江医药股份有限公司新昌制药厂 312500
摘要:［目的］研究无机盐对替考拉宁游动放线菌发酵代谢产物合成的影响。［方法］在发酵配方中加入一定比例的无机盐进行摇瓶实验及发酵罐实验。［结果］摇瓶实验中显示添加氯化钠不利于替考拉宁游动放线菌代谢产物合成；添加MgSO4、K2HP04对替考拉宁游动放线菌代谢产物合成基本无影响；添加硫酸铵比例约0.12%时，最有利于替考拉宁游动放线菌代谢产物合成。发酵罐实验中对硫酸铵添加0.12%比例进行再次确认，合成产物量有不低于20%的提高。
关键词: 替考拉宁 游动放线菌 无机盐 发酵
抗生素在近几十年来飞速发展，已经成为重要的生产工业。替考拉宁作为抗生素的一种，在药物治疗过程中起着较为重要的作用。替考 拉 宁 又 称 肽 可 霉素 ， 是 1978 年发 现 的一 种 新 的糖 肽 类 抗 生 素，由 游 动 放 线 菌产 生 ， 替 考 拉 宁 是 继 万 古 霉 素 之 后 的 又一 新 的糖 肽 类 抗 生 素，是 目 前临 床 上 治 疗 多 重 耐 药 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 和 肠 球 菌 感 染性 疾 病 的 首 选 药 物 之一［1］。替考拉宁具有比万古霉素更方便、更快捷的给药途径，可以静注或肌注给药，因此更利于门诊治疗或患者接受。
为了提高替考拉宁的产量，大量学术研究者致力于对其进行菌种筛选和发酵工艺的改良。本次实验亦旨在对其发酵配方进行优化，提高其合成产量。
1材料和方法
1 1菌种与培养基
1.1.1菌种
游动放线菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕ）由新昌制药实验中心实验室筛选保藏。
1 .1.2培养基及培养条件
固体培养基（g/L）：葡萄糖 1.5、酵母粉 1.5 、 K2HP0 4 1.1、 KC1 5.5、 MgSO4 0.5、 FeS04 0.06、琼 脂 20，pH6.8-7.2，培养温度（28 ± 1 ) ℃ ， 培养7 ~ 9 天,斜面标准为颜色黄色、厚。
种子培养基（g/L）：糊精 4.2、可溶性淀粉 20.0、酵母粉5.5、蛋 白 胨 2.2，CaC0 3 2.3，pH6.8-7.2
发酵培养基（g/L）：糊精 10.0、可溶性淀粉 18.0、黄豆粉20.0,玉 米 粉 15.0，CaC0 32.0，pH6.8-7.2
1.1.3 灭菌
固体培养基（平皿、斜面）于（120±2)℃灭菌25min，液体培养基（种子、发酵液）于（120±2)℃灭菌30min。
1.3 添加物：无机化合物（Nacl、MgSO4、K2HP0 4、KH2P0 4、硫酸铵）
1.4 仪器：三角烧瓶、恒温培养箱、旋转摇瓶机，种子罐：15L发酵罐，发酵罐：50L发酵罐
2方法
2.1摇瓶实验
2.1.1发酵液中加入一定比例的Nacl溶液的培养条件：从斜面上挖取成熟孢子接入1000ｍｌ装有种子培养基150 ml的三角烧瓶中，28ｏＣ， 200ｒ／ ｍｉｎ摇床振荡培养20 ~ 30 ｈ后， 移取2.5ml种子液接入250ｍｌ装有25 ｍｌ含不同比例Nacl溶液（配置发酵瓶培养基时按0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%比例添加）的发酵培养基的三角烧瓶中，各种发酵瓶3只，发酵培养140h后取样，测定其效价。
2.1.2发酵液中各自单独加入一定比例的K2HP0 4、 MgSO4溶液的培养条件：从斜面上挖取成熟孢子接人1000ｍｌ装有种子培养基150 ml的三角烧瓶中，２８ｏＣ， 20０ｒ／ ｍｉｎ摇床振荡培养20 ~ 30 ｈ后， 移取2.5ml种子液接入250ｍｌ装有25 ｍｌ含各自含不同比例K2HP0 4、 MgSO4溶液（配置发酵瓶培养基时均各自按0、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%比例添加）的发酵培养基的三角烧瓶中，各种发酵瓶3只， 发酵培养140h后取样，测定其效价。
2.1.3发酵液中加入一定比例的硫酸铵溶液的培养条件：从斜面上挖取成熟孢子接人1000ｍｌ装有种子培养基150 ml的三角烧瓶中，２８ｏＣ， 20０ｒ／ ｍｉｎ摇床振荡培养20 ~ 30 ｈ后， 移取2.5ml种子液接入250ｍｌ装有25 ｍｌ含不同比例硫酸铵溶液（配置发酵瓶培养基时按0、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%、0.18%比例添加）的发酵培养基的三角烧瓶中，各种发酵瓶3只，发酵培养140h后取样，测定其效价。
2.2工 艺 流 程
菌种细胞库 ——斜 面 ——种 子 罐—— 发 酵 罐
2.3发酵罐实验
种子罐配方参照种子培养基配方，２８ｏＣ，溶氧控制在25%以上，培养26ｈ。
发酵罐配方（g/L）：糊精10.0、可溶性淀粉18.0、黄豆粉20.0,玉 米 粉 15.0，CaC0 32.0，添加实验组效果较好比例的无机盐离子，pH6.8-7.2，溶氧控制在25% 以上，培养5天。实验组3次数据平均值作为统计结果
2.4效价测定
2.4.1参照高效液相色谱法（中国药典2015年版）测定
3.结果与讨论
3.1摇瓶实验结果
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从以上图表可以看出：
发酵摇瓶中加入Nacl，会使产物合成降低，且随着添加比例增加，产物合成产量呈下降趋势;发酵摇瓶中加入K2HP0 4、MgSO4对产物合成基本无影响;发酵摇瓶中加入硫酸铵有利于产物合成，随着添加比例增加，产物合成量呈上升趋势，但超过一定比例后，产物合成过程受到抑制，不利于产物合成 。按照最有利于产物合成的比例0.12%进行发酵罐实验，对其结果进行进一步确认。
3.2发酵罐实验结果
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实验结果表明，添加一定量的硫酸铵，确实有利于替考拉宁游动放线菌代谢产物的合成，合成产物量有不小于20%的提高。
此次实验替考拉宁产物合成量虽有较大提高，但发酵罐实验仅统计了产物合成的效价，培养过程工艺控制需进行更严密监控，且在硫酸铵添加过程中的pH,碳氮源的比例调控也需更进一步的研究。
参考文献
[1]夏振强，古勇，官家发 .糖肽类抗生素替考拉宁研究进展［J］,天然产物研究与开发2005,vol.17No.2 247-252