黄鹤，第二作者：李方静，
许昌市中心血站 河南 许昌 61000
摘要：目的 探讨标本溶血对ELISA法检测HBsAg结果的影响。方法 选择使用HBsAg呈现阳性与HBsAg呈现阴性的标本各60例作为研究对象，通过冰冻的方式令120例标本发生溶血。对于溶血标本通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBsAg，使用酶标仪对结果加以判定。结果 通过实验观察，HBsAg呈现阴性溶血标本检测HBsAg的假阳性率是30%，HBsAg呈现阳性溶血标本检测HBsAg的假阴性率是8.33%。结论 针对ELISA法对溶血标本进行HBsAg检测的过程中，比较容易出现假阴性或是假阳性。
关键词：标本溶血；ELISA；HBsAg
此次研究选取HBsAg呈现阳性与HBsAg呈现阴性的标本各60例作为研究对象，探讨标本溶血对ELISA法检测HBsAg结果的影响，现作出如下报告。
1 资料和方法
1.1 标本
本次研究对象为2019年3月—2020年3月在我站进行无偿献血的献血者。吸取HBsAg呈现阳性60例患者标本的3毫升全血，吸取HBsAg呈现阴性60例患者标本的3毫升全血，年龄在18-55岁范围内，平均年龄为（35.69±7.81）岁，其中包括58例男性，62例女性。采用冰冻的方式令120例标本发生溶血。
1.2 方法
1.2.1 溶血血清的制备
把需要进行检测的血清放置在-40°的冰箱中，时间为20分钟，将其取出在室温下融化，采用3000转/分的转速进行离心处理，分离出1.5毫升血清留作备用。
1.2.2 ELISA法检测HBsAg
严加遵照第四版《全国临床检验操作规程》、2019版《血站技术操作规程》实施相应检测。
1.3 统计学方法
使用SPSS21.0统计学软件处理实验研究中的相关数据，运用均数±标准差和%分别表示计量资料和计数资料，运用t和x2针对实验研究数据进行检验。P＜0.05表示存在明显差异，具有统计学意义。
2 结果
表一 120例溶血标本HBsAg检测结果
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3 结论
溶血通常可以分成体外溶血与体内溶血。关于体外溶血，主要是震荡、冰冻、抽血过程中负压偏大等物理因素，血样与表面活性剂发生接触等化学因素以及遗传病造成红细胞的脆性增加等代谢因素所导致。关于体内溶血，通常是由于化学、自身代谢以及药物等多方面因素所导致[1]。对于临床发生标本溶血的原因，具体可以概括如下：因为无偿献血者血管穿刺困难导致的溶血；因为抽血器具质量不符合标准例如真空管负压不足或过大或是试管质量相对偏差造成溶血的发生；因为采血工作者采血后颠倒混匀操作不当造成的溶血等。发生溶血过程中除却比较常见到的红细胞被破坏以外，白细胞和血小板等血细胞破坏而释放的部分胞内成分也会对相应临床检测结果的判断产生干扰或是影响。
当前，ELISA法是我国最为常用的乙肝表面抗原检测法，这一方法灵敏度能够达到ng/ml的级别。具体操作中存在诸多方面的影响因素，其中反应温度、洗板、血清分离以及时间是比较主要的因素。本次研究中，HBsAg呈现阴性溶血标本检测HBsAg的阳性率是30%，HBsAg呈现阳性溶血标本检测HBsAg的阴性率是8.33%。相较于孙艳霞[2]报道的41.7%与11.7%更低，充分说明溶血标本通过ELISA法对HBsAg进行检测的过程中比较容易出现假阴性或是假阳性。究其原因是反应孔对溶血血清中血红蛋白的非特异性吸附与溶血过程中细胞内液对于血清所产生的稀释作用。
溶血导致假阳性的原因为：溶血过程中破坏了红细胞，胞内血红蛋白进入到血清中，血红蛋白存在相似于过氧化物酶活性的特点，起到的作用和辣根过氧化物酶比较相似，若是反应孔非特异对血红蛋白吸附而出现残留，便对底物产生催化作用而显色，导致本底OD值变高，甚至出现假阳性的情况。根据相关报道显示，溶血能够明显升高HBsAg的OD值，会导致假阳性的检测结果。溶血标本中的血红蛋白存在相似过氧化物酶的活性，在温育中吸附于固相，很难彻底洗脱，会对底物催化显色导致假阳性结果的出现。“钩状效应”是导致溶血假阴性比较主要的原因，例如标本中HBsAg浓度偏高，便由于竞争抑制的原因，很难使“夹心复合物”形成，产生显色变浅甚至不会显色的情况，我们称之为Hook现象，造成HBsAg出现漏检。ELISA试验中酶标反应板孔包被物的浓度是一个相对的定值，抗原抗体反应具有最适比例与后带的情况，HBsAg浓度和OD值仅仅是在一定范围中呈现出线性的关系；在HBsAg达到相应浓度的过程中OD值的变化会进入至平台期；若是HBsAg的浓度过高，OD值反而会下降。所以，溶血能够令HBsAg浓度较高样品的OD值变大，使后带的情况得到了一定解决；在HBsAg浓度和OD值呈现线性关系时才会由于溶血的稀释作用导致OD值降低；在HBsAg浓度接近临界值时，可能导致假阴性结果的出现。
所以，标本溶血不宜采用ELISA法对HBsAg进行检测。产生影响的大小和性质会由于应用试剂、使用的检测方法、洗板质量的优与劣以及标本HBsAg的有无和浓度高与低而有所不同。若是洗涤质量相对较好，便会大幅降低或是排除非特异性吸附所造成的干扰。对于部分特定原因溶血标本，无法进行再次采血时，可以通过二步法执行相应操作，这样可以明显降低过氧化物酶产生残留的概率，有效排除溶血释出的血红蛋白对HBsAg检测结果造成影响，降低假阳性的发生概率。
总而言之，为了有效降低ELISA法对HBsAg进行检测过程中产生误差的概率，标本在采集、运送、分离以及检测中需要尽可能规避人为原因导致的溶血。所以相关采血工作者需要保证抽血的规范性，避免出现溶血标本。严加根据试剂盒说明书进行操作，对照好阴性、阳性和临界值。结果的判定需要应用酶标仪，降低人为误差。做好实验室的质量控制工作，确保检测结果更加精准，同时针对具体的检测过程执行严格的标准化流程。
参考文献：
[1]李玉娟, 杨丽. ELISA法检测HBsAg影响因素分析[J]. 中外医疗, 2009, 28（026）:172-173.
[2] 孙艳霞.简要分析标本溶血对ELISA检测血清乙肝表面抗原的影响[J].标记免疫分析与临床, 2009,16（4）:253-254.