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一文带你了解冰冻切片

发表时间：2021/3/22 来源：《医师在线》2020年11月21期作者：宋体梅

[导读] 一文带你了解冰冻切片

宋体梅
（蓬安县人民医院；四川蓬安637800）
　　冰冻切片指的是采用切片机对冷冻状态下的组织进行直接切片，实际上是通过水作为包埋剂，冰冻组织至坚硬状态后切片。在冰冻切片前，不采用化学药品处理或加热组织，以此大大缩短纸片时间。同时该纸片法无需脱水透明和浸蜡等步骤，多用于脂肪、神经组织和部分组织化学的纸片，作为一种高效的切片方式在临床诊断中广泛应用。
一、术中为何要做冷冻切片？
　　众所周知，手术病理诊断中通常会做快速冷冻切片，但是很多人不一定了解为什么要做冷冻切片，其他切片也可以代替冷冻切片吗？常标准石蜡切片是临床病理检查中最常用的方法。通常的做法是将脏器切除，并进行一系列后续的技术处理，包括固定、脱水、石蜡浸渍、包埋、切片、染色。正常切片过程至少需要24小时完成，检查医师用显微镜观察分析，做出病理诊断，前后约需要3天。一些外科医生没有太多的等待时间，需要在手术过程中立即了解病变的性质，从而缩小手术范围，进行合理的处理，这需要手术中的医生进行病理诊断，因此需要活检诊断速度快、效率高，冷冻切片时间短，通常需要30分钟左右的时间来完成整个诊断过程，外科医生可根据病理诊断改进手术方式，避免多次二次麻醉和手术，大大降低了患者的重复费用。
二、如何开展冷冻切片？
　　（一）取材
　　应尽可能地在短时间内取得新鲜的材料，避免组织产生死后变化。
　　（二）速冻
　　为了保护细胞内的酶活性，缩短切片标本的制备时间，通常需要在取样后冷冻组织块，降低组织温度，缩短冷却时间，避免冰晶的形成。

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实验室冷冻切片最常用的方法为液氮冷冻切片法，具体操作方式为将软塑料帽或专用小盒放入组织中，如组织块过小，则加入COT浸泡包埋介质组织，准备小杯、液氮，将小盒放入小杯中，当小盒底部与液氮沸腾气化反应时，保持小盒原位避免浸入液氮中，但是10到20秒，组织就会迅速冻结成碎片。制成冷冻块后，放入冰箱的常备切片机中进行冷冻切片。如需保存，可快速用铝箔或塑料薄膜密封包装，并在-80℃冰箱保存。
　　（三）固定
　　在样品托表面涂上OCT包埋胶，放置速冻组织在上，放入4℃的冰箱预冷5~10分钟，让组织内的OCT胶渗透。取下组织放在锡箔或玻片上，速冻样品托。将组织放在样品托上，添加一层OCT胶完全覆盖，放在速冻架上冷冻30分钟。
　　（四）切片
　　理想选择恒温冷冻切片机，放置在密闭的低密度房间内。因此，切片时，外部温度和环境不影响切片效果，切片可可持续切割至5~10μm。切片时，低温室温度应保持在-15℃~-20℃。温度太低，组织容易破裂。防滚板的位置和角度要放置好，组织要放在玻片上切片。切割后,离开30分钟,将丙酮置于4℃为5 ~ 10分钟修复它,然后把它放入烤箱干了20分钟。PBS洗3次，每次5分钟。可采用抗原性热修复、微波热修复和室温自然冷却。用3%的h2o2孵育5次，每次10分钟，可消除内源性过氧化物酶活性。
（五）免疫荧光染色
　　冷冻切片室温干燥15min。在室温下用10%的正常山羊血清PBS密封冷冻切片1小时，根据稀释率加入一级抗体工作液。切片置于PBS浸湿的免疫组化盒中，在温室中孵育2小时。第二天，将湿的盒子置于37℃，并将温度恢复1小时。然后将片上的一抗吸收回收，切片放入小染缸中PBS洗涤。将PBS滴注稀释的二抗置于37℃分子杂交室中孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸中，PBS洗涤5min，洗涤3次。加入工作溶液染细胞核，室温保持10~20分钟。回收DAPI，加入5-10UI抗荧光衰减密封胶或中性胶。用盖玻片密封车牌，在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察车牌。切片后放入盒中，4℃冷藏一周。
三、小结
　　综上所示，冰冻病理切片时间短，速度快，30分钟内就能够完成病理诊断，可为手术提供准确的诊断方案，可有效提高手术成功率。