范文婷
（四川省荣县人民医院病理科；四川自贡643100）
摘要：目的 了解荣县地区女性感染人乳头瘤病毒（HPV）感染情况及基因型别分布情况，为荣县地区女性HPV感染流行病学调查研究提供科学依据。方法 对9423例宫颈脱落细胞学标本采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合检测HPV感染的基因亚型，分析不同年龄段女性HPV感染情况。结果在9423例就诊女性中，HPV阳性2644例，阳性率为28.06%；23种亚型均被检出；HPV阳性患者中，主要为单一型感染者1702例，占64.4%；多重感染者942例，占35.6%。高危型HPV感染中最常见的亚型前五位为：52/16/58/53/51；低危型HPV感染中最常见的亚型前五位为：6/81/43/11/42。HPV感染高峰为15~20岁阶段及71~84岁阶段。结论荣县地区女性HPV基因型的分布具有明显的年龄和区域分布特异性。HPV基因型检测对于荣县地区HPV感染的诊疗、预防性疫苗的使用及宫颈癌的早期干预和预防有重要意义。
Abstract: Objective To understand the infection of human papillomavirus (HPV) in women in Rongxian area and the distribution of genotypes, and to provide scientific basis for the epidemiological investigation and study of HPV infection in women in Rongxian area. Methods For 9423 cases, cervical shedding cytological specimens were used to detect the gene subtype of HPV infection by combining PCR introplification with DNA reverse point hybridization, and to analyze hpV infection in women of different ages. Results Of the 9423 women who were treated, 2644 were positive for HPV, with a positive rate of 28.06%, and 23 subtypes were detected. Of the HPV-positive patients, 1702, or 64.4%, were mainly single-type infected, and 942, or 35.6%, were multiple infections. The top five most common subtypes in high-risk HPV infections are: 52/16/58/53/51, and the top five most common subtypes in low-risk HPV infections are: 6/81/43/11/42. The peak of HPV infection is 15 to 20 years of age and 71 to 84 years of age. Conclusion The distribution of HPV genotype in women in Rongxian area has obvious age and regional distribution specificity. HPV genotype testing is of great significance for the diagnosis and treatment of HPV infection, the use of preventive vaccines and the early intervention and prevention of cervical cancer in Rongxian area.
关键词：人乳头状瘤病毒；分型检测；PCR体外扩增；
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率呈上升趋势。据统计，我国女性每年新发的宫颈癌患者超过13万，并明显趋于年轻化。[1]大量的流行病学研究和分子生物学研究已证明人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌和上皮内病变发生的必要因素。目前已知的HPV基因型有100多种，其中约40种与生殖道感染有关，且不同HPV亚型对宫颈上皮的致病性不同。根据HPV型别与宫颈癌发生危险性的高低分为高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV与宫颈癌及宫颈上皮内病变相关，低危型HPV常引起生殖道疣等良性病变。[2]从高危型HPV持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要5~10年。目前，HPV疫苗已在国内外上市，应用于临床。此外，不同地区，不同人群，HPV感染基因型存在一定差异。因此，有针对性地进行HPV分型检测对于宫颈癌的早期诊断及疫苗选择有重要意义。本文中调查荣县地区2015年6月~2020年6月中9423例来院就诊女性的宫颈拭子，利用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的方法进行HPV分型检测，旨在为荣县地区女性HPV疫苗的临床应用提供流行病学依据，对宫颈癌的早期筛查、早期预防和早期干预提供帮助。
1资料与方法
1.1一般资料 选取2015年6月~2020年6月在荣县人民医院体检女性、妇科就诊女性及皮肤性病门诊就诊女性，共9425例，年龄15~84岁，平均42.95（+-9.284）岁，其中15~30岁1146例；31~40岁1915例；41~50岁4751例；51~60岁1349例；61岁~84岁262例。
1.2仪器与试剂 人乳头瘤病毒基因分型（23型）检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）；基因扩增仪?HEMA（型号9600??横海黑马医学仪器有限公司）；微量台式高速离心机??（型号H1650-W?湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；恒温杂交仪（深圳亚能生物技术有限公司）。
1.3标本采集 使用专用的一次性宫颈脱落细胞采集器采集脱落细胞，用采集刷深入受检者宫颈口，单方向旋转4~5周，将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，旋紧洗脱管盖，做好标识，直立放置。应将标本置于4℃条件下保存，7天内检测。-20℃保存不超过3个月，避免反复冻融。
1.4方法
1.4.1HPV DNA提取 充分洗脱宫颈刷，并在管壁挤干。把洗脱液全部转移到1.5ml离心管中，13000rpm离心10分钟，弃上清液，保留管底的细胞沉淀。加入50?裂解液悬浮沉淀，沸水浴加热10分钟。13000rpm离心10分钟，保留上清液待用。
1.4.2PCR扩增 取反应液Ⅰ、Ⅱ于室温融化并振荡混匀，低速离心数秒，然后取出PCR管，做好标记，分别加入20?反应液和5?已提取的待测样本DNA，反应总体积为25?，低速离心数秒，放入扩增仪。程序设置为：50℃ 15min；95℃ 10min；94℃ 30sec，42℃ 90sec，72℃ 30sec（循环40次）；72℃ 5min。
1.4.3杂交 取15ml塑料离心管，放入标记好的膜条，加入A液5~6ml及所对应的PCR产物。将离心管放入沸水加热10分钟，放入杂交箱51℃杂交1.5小时。取50ml塑料离心管，加入50mlB液于杂交箱中预热至51℃。
1.4.4洗膜 取出膜条，移至装有预热B液的50ml管中，于51℃轻摇洗涤5分钟。
1.4.5显色 膜条放入孵育液中，室温轻摇浸泡30分钟，弃去孵育液，用A液室温轻摇洗涤两次，每次5分钟。用C液室温洗膜1~2分钟。将膜条浸泡于显色液中，避光显色30分钟即可观察结果。
1.4.6结果判读 确认IC点上出现蓝色斑点，再根据膜条上蓝色斑点显现位置，读取相应位置上标注的基因型信息。
1.5统计学处理 实验采集的相关数据采用excel、SPSS25.0软件进行统计学分析。不同年龄段HPV感染检出率的比较采用x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1HPV总体感染情况
2015年6月~2020年6月共进行HPV分型检测9423例，其中阳性2644例，阳性率为28.06%（2644/9423），检测的23种亚型均有检出。由于在2644例感染阳性标本中存在多重感染情况，因此在阳性标本检出的总亚型次数为4214次，总的亚型检出率为44.7%（4214/9423）。在感染阳性标本中，以高危型HPV感染为主。高危型HPV感染中最常见的亚型前五位为：52/16/58/53/51（表1）；低危型HPV感染中最常见的亚型前五位为：6/81/43/11/42（表2）。
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2.3 各年龄段感染情况分析
感染女性年龄范围为15岁~82岁，平均年龄43.28（+-10.503）岁。筛查人群的高峰年龄为21~60岁，而HPV感染率最高为15~20岁阶段及71~84岁阶段（阳性检出率分别为59.67%、52.08%）。各年龄组感染率差异有统计学意义（x2=123.425，P＜0.01）。见表4
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3 讨论
3.1人乳头瘤病毒感染率和型别分布
本研究发现，2015年6月~2020年6月到院就诊的女性HPV感染率为28.06%，检测的23种亚型均有检出。在感染阳性标本中，以高危型HPV感染为主。高危型HPV感染中最常见的亚型前五位为：52/16/58/53/51；低危型HPV感染中最常见的亚型前五位为：6/81/43/11/42。据刘灵燕[2]等研究报道，北京地区主要以HPV52/58/16亚型为主，武汉地区主要以16/56/58亚型为主，浙江地区则以16/11/58/6亚型为主；据毛晓雪[3]研究报道自贡地区感染以31/52/16亚型为主。据李灿[4]等研究报道，在四川省内HPV感染率，成都市农村地区为21.98%，川东北地区为49.12%，泸州地区为52.45%，内江地区为12.3%，而自贡市内为25.77%[3]。本研究结果显示，我县HPV基因型别分布，与国内报道的大部分区域基本相同，HPV感染率与自贡市区较为接近。这说明HPV基因型分布存在地区差异，同一城市不同区域之间亦存在差异，可能与经济、生活习惯等因素有关。
3.2 HPV多重感染
本研究发现，在2644例阳性样本中，HPV多为单基因型感染，占感染人群的64.4%，且以单一高危型为主（占49.8%），常见高危型依次为52/16/58/53/51亚型；多重感染者占感染人群35.6%，最常见的为二重感染，最多检测到14重感染。在多重感染中，最常见HPV52型别合并的感染，其次为HPV16或HPV58型。施启丰[5]等研究发现，深圳地区多重感染中，最常见HPV16型合并的感染，其次为HPV58型和HPV52型。说明HPV混合基因型感染也存在地区差异。研究[2]表明，多重感染尤其是多重高危型感染会大大增加宫颈癌变风险，提示临床上应重视多重感染者，建议积极治疗并密切随访，降低宫颈癌的发生风险。
3.3 HPV感染的年龄分布
本研究结果显示，HPV感染率年龄分布呈“中间低两头高”的U型分布[6]，2个感染高峰分别为≤20岁和≥71岁，与国内外研究基本一致。出现此情况，可能与此年龄段女性样本数量相对较少，多数因有临床症状前来就诊，因此感染率相对较高。≤20岁年龄组检出率高于其他年龄组，这可能与女性性生活过早、过频、性伴侣较多有关，主要是由于该年龄段的女性生殖道尚未发育完全，因此对病毒的抵抗力较弱。此外，由于该年龄段女性缺乏自我保护和保健意识，因而极易发生HPV感染。相关研究发现，虽然大部分年轻女性感染高危型HPV后可以自然清除，但持续性感染则可能罹患宫颈癌，因此需要接种HPV疫苗来进行预防。＞60岁年龄组检出率有所回升，这可能与年长者抵抗力下降，，更年期后体内雌激素水平下降，绝经期后病毒持续性感染或病毒重复感染等因素相关。由于老年女性性生活逐渐减少，其HPV感染水平可能反应HPV持续感染状态[7]。结合地域及经济因素，也与老年女性卫生习惯不良，健康意识缺乏等因素有关。因此，需要对老年女性HPV阳性引起高度重视，要做好随访宣传和宫颈癌筛查工作。
3.4 疫苗选择
宫颈癌是一种由人乳头瘤病毒持续感染引起的恶性肿瘤，是目前唯一一种病因明确、能有效预防、早期发现、并且能早期治疗的癌症[6]。因此，对女性群体进行HPV 筛查具有重要意义。接种HPV疫苗是预防宫颈癌的有效手段，目前已经上市的HPV预防性疫苗有2价、4价和9价疫苗，2价疫苗主要针对HPV16/18亚型，4价疫苗主要针对16/18/6/11亚型，9价疫苗在4价疫苗基础上增加了31/33/45/52/58五种亚型[2]。结合本研究发现，荣县地区感染率居前5位的高危型为52/16/58/53/51，前五位低危型为6/81/43/11/42，为本地区内HPV疫苗的选择提供有力依据，以达到更好的预防效果。
综上所述，加强女性HPV分型检测，了解HPV的感染情况及亚型分布，对于发现HPV感染的高危人群，积极控制HPV感染，有针对性地选择疫苗，降低宫颈癌的发生具有重要意义。
参考文献：
[1]邱顺华，金李芬.自贡地区女性15种高危型人乳头瘤病毒感染情况分析[J].国际检验医学杂志,2017,38（3）：421~422
[2]刘灵燕，郭竹英等.上海市宝山区HPV基因分型的特征分析[J].蚌埠医学院学报.2020，45（3）：384~387
[3]毛晓雪.自贡地区妇科就诊患者HPV检测及结果分析[J].国际检验医学杂志.2016，37（7）：990~991
[4]李灿，陈伟，等.妇科门诊病人HPV分型检测及感染情况分析[J].2015，17（3）：253~255
[5]施启丰，韩春荣，耿建祥，等.女性宫颈人乳头状瘤病毒多重感染的基因型对比研究[J].中华医院感染学杂志，2014，24（19）：4708.
[6]何彩华，曾祥兴.人乳头瘤病毒基因型检测机器人群分布特征.国际免疫学杂志.2014，37（6）：549~553
[7]李见，王露.徐州地区人乳头瘤病毒感染及病毒分型与宫颈病变的关系[J].中国性科学.2020，29（1）：130~134