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肝组织石蜡切片的制作

发表时间：2021/3/26 来源：《医师在线》2020年11月21期作者：张中军秦万生

[导读]

　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　张中军秦万生
　　　　　　　　　（洛阳职业技术学院；?河南?洛阳??471001）
　　　　　　　
　　关键词：肝组织；石蜡切片；制作
　　
1 制片
1.1 取材与固定??固定的目的在于保存肝组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。
　　将家兔杀死后，快速打开腹腔，用锐利的刀片割取小块肝组织。肝组织块的大小以厚度不超过5 mm为宜。然后，将取下的肝组织迅速投入Bouin 氏固定液中。固定时间为数小时至24小时（需视组织块的大小而定）。
1.2 冲洗??经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在肝组织中会有碍染色。
　　用Bouin 氏液固定的材料，可直接移入70%酒精中，多换几次酒精，直至无黄色为止。也可在酒精中加入几滴氨水或饱和碳酸锂水溶液，以迅速洗去黄色。但留少许黄色也无防碍。
浸洗后的材料若暂时不制片，可保存于70%酒精中。
1.3 脱水??柔软并含有多量水分的肝组织是不易切成薄片的，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将肝组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。
　　常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是：将材料依次经70%酒精、80%酒精、95%酒精（Ι）、95%酒精（Ⅱ）、无水酒精（Ⅰ）、无水酒精（Ⅱ），各级酒精1~2小时。脱水彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。
1.4透明??酒精与石蜡不能混合，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明剂透明。透明剂即可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。将脱水后的材料经1：1无水酒精与二甲苯、二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ），各级时间为0.5~2小时，务必肝组织达到透明为止。
1.5 浸蜡??将已透明的材料移入溶化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除肝组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切片。
先将装56~58℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒温（约58℃左右），切勿太高太底。然后将透明了的材料放入蜡杯（Ⅰ）、蜡杯（Ⅱ）、蜡杯（Ⅲ）。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为2~4小时左右。
1.6 包埋??将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。
　　包埋前，视肝组织块的大小将绘图纸折成一纸盒，作为包埋的容器。将纸盒盛满已熔化的石蜡，随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。然后速将纸盒半浸于冷水中，待石蜡表面凝结后，将纸盒全部浸入水中冷却。

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石蜡全部凝固后，拆去纸盒即成蜡快。
1.7 切片??切片前，先将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正方形或长方形，否则切出的蜡带弯曲不直，或无法连成带状。
　　将修整后的蜡块粘在小木块上，小木块装切片机上，以待切片。在旋转式切片机上将蜡块切成4~8 um厚的薄片。切下的薄片连成蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用。
1.8 贴片和烤片??将蜡片粘贴在载玻片上即为贴片。用小玻璃棒蘸取一点蛋白甘油于一干净的载玻片上，用手指涂匀，并加几滴蒸馏水于载玻片上。将蜡带按要求切成适当长度的蜡片，然后用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上，再把载玻片放在展平台上（温度为45℃左右）。蜡片守热后，即慢慢展平。待完全展平后，用解剖针将切片位置拨正，倾去载玻片上的余水后，将其放在烤片盒中，置于50℃左右恒温箱内烤干。
1.9 染色??染色剂多为水溶剂，故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。染色方法众多，以染色法而言有下列步骤：
1.9.1 脱蜡??将烤干的切片放入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中，各为5~10min ，以溶去切片上的石蜡。
1.9.2 复水??是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐步下降到水的过程，即将二甲苯（Ⅱ）中取出的切片移入无水酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精和蒸馏水，各级中停留1~5min 。
1.9.3 染色??（1）将蒸馏水洗涤后的切片移入 Harris氏苏木精液中5~10min ，使细胞核着色。（2）用自来水洗去切片上残余的染液。（3）用1%盐酸酒精分色数秒钟。分色就是褪去细胞质不应着色部分的颜色，而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片，使分色适度。（4）入0.1%氨水或自来水浸洗，使之蓝化。（5）在蒸馏水中浸片刻。（6）切片入70%、80%、90%酒精各1~2min 。（7）入0.5%曙红酒精溶液中染2~5min ，使细胞质着色。
1.10 脱水和透明??切片依次入95%酒精（Ⅰ）95%酒精（Ⅱ）、无水酒精（Ⅰ）、无水酒精（Ⅱ），各级中停留1~5min ，进行脱水。
　　切片入1：1无水酒精二甲苯、二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ），各级中停留1~5min ，进行透明。
1.11 封藏??将切片从二甲苯（Ⅱ）中取出，用纸或布檫去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶，然后，用镊子加盖盖玻片。切片封好后，放在切片托盘上待树胶干燥，即可用来观察。
2 结果?
　　制作的家兔肝组织切片，在显微镜下可清晰分辨出肝小叶的结构，其中肝细胞核呈现鲜艳的蓝色，肝细胞质及细胞间质呈粉红至红色。
3 讨论
　　制片是一个连续的操作过程，往往要连续几天才能完成，因此，事先一定要制定工作计划，应按顺序进行工作。这样可避免和其它工作发生冲突，也不会因前后顺序颠倒或超过了规定的时间，给工作带来不必要的损失。
　　制片的各个步骤都是互相关联的，如脱水不彻底就会影响到透明的程度，以至影响蜡块的质量。为此，必须对任何一个步骤，都要细致、严格地进行操作。
　