铜绿假单胞菌注射液调节免疫及抗肿瘤的机制以及临床应用现状
刘盼 赵毅通讯作者
中国医科大学附属盛京医院 辽宁 沈阳 110000
【摘要】铜绿假单胞菌注射液其主要成分为铜绿假单胞菌甘露聚糖敏感株(PA-MSHA)，通过体外及体外等多种试验表明其可通过调节树突细胞及Toll样受体调节机体免疫，可以通过抑制VEGF及EGFR、阻断细胞增殖周期起到抗肿瘤的作用，而且PA-MSHA在临床中在手术术后、联合化疗、联合放疗及提高免疫等方面的应用十分广泛。本文将从铜绿假单胞菌注射液调节免疫的机制、发挥抗肿瘤的机制及其临床应用的现状三个方面做以综述。
【关键词】铜绿假单胞菌注射液 抗肿瘤 调节免疫
Abstract The main component of Pseudomonas aeruginosa injection is mannan-sensitive strain of Pseudomonas aeruginosa (PA-MSHA). In vitro and in vitro experiments show that PA-MSHA can regulate immunity by regulating dendritic cells and Toll-like receptors, and can play an anti-tumor role by inhibiting VEGF and EGFR and blocking cell proliferation cycle. Moreover, PA-MSHA is widely used in postoperative, combined chemotherapy, combined radiotherapy and improving immunity. In this paper, the mechanism and clinical application of Pseudomonas aeruginosa injection in regulating immunity and anti-tumor are reviewed.
Key words PA-MSHA anti-tumor immunoregulation
铜绿假单胞菌甘露聚糖敏感株(PA-MSHA)是由我国微生物学家牟希亚教授建立的一株具有甘露聚糖敏感菌毛的铜绿假单胞菌。他采用生物工程技术使非MSHA热灭活铜绿假单胞菌菌株的菌丝体周围有许多纤细直立的MSHA菌毛，被认为有调节免疫的功能，并能够抑制人恶性肿瘤细胞的体外增殖，对结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤具有广谱抑制作用，其在临床在也有广泛的应用，本文就铜绿假单胞菌注射液调节免疫及抗肿瘤的机制以及临床应用现状做以综述。
1、调节免疫机制
肿瘤细胞是机体正常细胞恶变的产物，其特点是不断增殖并且在体内通过多种方式转移。机体的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，均可对肿瘤产生免疫应答。因此通过激发和增强宿主的免疫反应可以提高机体对肿瘤细胞的清除作用。抗原提呈细胞在免疫应答中能摄取、加工、处理并将抗原信息提呈给淋巴细胞，诱发T、B细胞发生免疫应答。其中成熟的树突状细胞（Dendritic Cells,DC）是免疫系统的核心成员，被认为是最有效的抗原提呈细胞，可以诱导免疫激活或促进耐受[1]，在癌症免疫治疗中被广泛用于刺激特异性抗肿瘤免疫反应，因为它们可以在体外和体内均可以有效地识别并向T细胞呈递肿瘤抗原，因而也被认为是免疫治疗的有前途的靶点[2]。其状态在启动和引导免疫反应中起着关键作用。树突状细胞通过在T细胞启动时提供共刺激和建立细胞因子环境来影响T细胞增殖和效应细胞功能。成熟的T细胞离开胸腺，收到抗原刺激后可分化为TH1和TH2型。由DC产生的白细胞介素-12和肿瘤坏死因子-a是Th1极化的关键细胞因子，而不能产生白细胞介素-12p70的DC被认为能促进Th2反应的产生[3]。T细胞极化的方向决定了许多传染病和癌症的预后。Th1细胞高表达癌症患者无病生存期延长，而Th2细胞高表达的患者进展不佳[2,4]。这是由于Th1主要
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第一作者：刘盼 单位：中国医科大学附属盛京医院(沈阳 110000)
E-mail:15702449785@163.com
通讯作者：赵毅 单位：中国医科大学附属盛京医院(沈阳 110000)
E-mail:zhaoy5@sj.hospital.org
作用是增强细胞免疫和发挥抗肿瘤抗感染，而Th2与肿瘤的感染和进展有关。许多研究表明Th1/Th2平衡与许多疾病的结果密切相关。如，Th1 / Th2在乳腺癌中是失衡的，Th1型细胞因子被抑制，而Th2型细胞因子被相对增强[5]。
既往研究表明，PA-MSHA有降低树突状细胞的内吞能力，可以上调HLA-DR、CD80、CD11c和CD40的表达，进而诱导树突状细胞分泌白细胞介素-12，促进T细胞向Th1的分化，增强了机体的细胞免疫，提高了抗肿瘤功能。Min Zhang等试验中肺癌荷瘤小鼠在经过PA-MSHA治疗后，肿瘤部位的T细胞数量和DC成熟度均显著增加[6]，证明PA-MSHA可以诱导树突状细胞成熟，进一步促进抗原呈递功能，促进T细胞向Th1分化，提高机体免疫功能。
Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）可以识别多种外源病原体，作为一类重要的蛋白质参与机体的非特异性免疫。当微生物突破机体的皮肤、粘膜等物理屏障时，TLR可以快速的识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。因而TLR在非特异性与特异性免疫的连接中起着十分重要的作用，主要包括细菌脂多糖(LPS)、细菌鞭毛以及细菌和病毒单链和双链RNA 。树突状细胞可以表达多种TLR，通过这些TLR识别多种微生物化合物。TLR介导的DC活化对于建立有效的抗肿瘤免疫反应非常重要[7]。
研究表明，PA-MSHA可以刺激先天免疫细胞，如巨噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞，通过Toll样受体信号激活树突状细胞(DC)来增强抗原呈递功能，以诱导Th1型免疫反应或调节免疫反应[8]。PA-MSHA在体外实验组中也表现出更高的共刺激分子表达、更多的细胞因子分泌、更低的内吞活性和更强的增强T细胞激活能力。PA-MSHA作为一种新的TLR4激动剂，可诱导抗肿瘤免疫反应，减缓肿瘤进展[9]。腹膜乳斑被认为是胃癌肿瘤细胞腹膜播散的起源部位。Miao Z F等研究[10]表明PA-MSHA能通过toll样受体4/9依赖机制激活腹膜乳斑巨噬细胞，使其向经典的激活表型M1型转化，经典活化的巨噬细胞(M1)被描述为具有抗肿瘤作用的促炎细胞，因此PA-MSHA能间接的起到抗胃癌肿瘤细胞的作用，降低胃癌的腹膜转移率，减少胃癌死亡率。由此可见，将TLR激动剂—PA-MSHA用于活化DC细胞或巨噬细胞等也是启动或促进抗肿瘤反应的一种有效的方法。
2、抗肿瘤机制
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与许多血管生成依赖性疾病的发病及其进展，包括癌症、某些炎性疾病以及糖尿病视网膜病变等，对血管形成至关重要。血管内皮生长因子由饥饿的癌细胞分泌，以刺激微血管通透性和内皮细胞增殖、迁移和存活。据报道，血管内皮生长因子与乳腺癌的肿瘤大小呈正相关[11]。所以另一种有效的抗肿瘤策略就是通过阻断血管内皮生长因子信号通路来抑制肿瘤新血管生成，从而达到抗肿瘤的目的。抗血管内皮生长因子药物被证明可用于对抗肾细胞癌[12]和肺癌[13]。在小鼠试验中，小鼠血管内皮生长因子和微血管密度也减少了，试验药品PA-MSHA显著延长了小鼠的生存期并减少了肿瘤的生长[14]，证明通过抑制VEGF信号通路达到抗肿瘤的目的是可行的，而且PA-MSHA完全可以做到。
表皮生长因子受体(EGFR)是一种调节细胞增殖、转移和血管生成的原癌基因,在许多癌症中过度表达或突变，特别是在乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌中。EGFR的过度表达和过度激活与不良预后、耐药性、癌症转移和较低的生存率相关,也已被证明是维持肿瘤细胞增殖能力的重要组成部分。EGFR受体已经成为开发癌症疗法的主要选择[15]。
EGFR抑制剂可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖,而PA-MSHA就是一种EGFR抑制剂。EGFR的异常在非小细胞肺癌中诱发显著的致癌潜能[16]。EGFR特有的酪氨酸激酶抑制剂用于转移性非小细胞肺癌患者的二线甚至一线治疗，但经常发生耐药反应，而实验证明[17]PA-MSHA增强吉非替尼对非小细胞肺癌细胞的生长抑制作用，PA-MSHA单独或与吉非替尼联合应用可以克服肺癌细胞对其的耐药性，为EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌的治疗提供一种新的策略。在包括胰腺癌在内的许多实体瘤中，EGFR过度表达和/或活性增强[18]。EGFR的激活导致磷酸化和下游信号成分的激活，并导致细胞增殖[19]。与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中EGFR [20]的表达更高。PA-MSHA通过抑制EGFR信号通路达到抑制胰腺癌细胞增殖的目的，通过诱导细胞内超微结构改变，诱导胰腺癌细胞凋亡[21]。PA-MSHA在体内外均能抑制膀胱癌细胞凋亡[22]，其诱导EGFR信号通路中设计的几个关键调节因子如聚乙二醇单丁醚、磷酸腺苷激酶和磷酸腺苷激酶的蛋白水平的剂量依赖性降低，抑制EGFR受体信号通路激活，在体内外均能抑制膀胱癌细胞凋亡。Z-B Liu[23]等对荷瘤小鼠异种移植乳腺癌细胞株，以甘露糖共培养。实验结果是用PA-MSHA刺激的细胞表现出EGFR信号的下调。在体内，PA-MSHA显著抑制了小鼠异种移植物中的乳腺癌的发生，而且肿瘤样品分析证实了PA-MSHA是通过EGFR通路实现抗肿瘤作用的。因而，在EGFR过度表达的乳腺肿瘤中，PA-MSHA可以通过抑制EGFR通路信号起到乳腺癌细胞的转移的作用。
细胞周期，是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束的过程，包括间期和分裂期。其中间期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。在G1期中，可以迅速合成RNA和蛋白质，导致细胞体积显著增大，为下阶段S期的DNA复制作物质和能量的准备。S期合成DNA、组蛋白以及DNA复制需要的所有酶。G2期是有丝分裂的准备期，DNA合成终止，会合成大量的RNA及蛋白质。停止在G1期的细胞被称为休止细胞或G0期细胞，这类细胞受某种刺激后仍能进入周期，继续进行有丝分裂。肿瘤细胞由于失去宿主的调控会恶性增殖，所以在肿瘤治疗中可应用细胞周期的原理。研究表明本文中讨论的药物PA-MSHA能诱导膀胱癌细胞凋亡和G0-G1细胞周期停滞[24]，也可以通过剂量依赖性方式在细胞周期的G0-G1期阻滞非小细胞肺癌细胞，使S期细胞比例的降低，抑制其增殖，重新分配细胞周期，诱导细胞凋亡[25]。在宫颈癌[26]及胰腺癌中[27]同样可以观察到类似的结论。
PA-MSHA是由普通I型菌毛与铜绿假单胞菌自身菌毛及菌体结合在一起，有高效及广谱的免疫原性。其关键有效药理学位点位于菌毛中，为甘露糖敏感性结合蛋白，可与高甘露糖型肿瘤细胞表面上的丰富甘露糖残基特异性结合[31],这种特定的组合能够抑制细胞增殖，诱导细胞周期停滞，并诱导人癌细胞凋亡。廖伟娇等试验也表明PA-MSHA在体外刺激淋巴细胞活化，促进CD2+、CD69+、CD25+细胞增加，而CD69+、CD25+是活化T淋巴细胞的标志[28]，表明PA-MSHA具有活化T淋巴细胞的功能。 由于PA-MSHA利用了癌细胞的糖结合特性，针对多种糖的治疗可能是一个有吸引力的前景，特别是作为癌症治疗的新目标。
3.临床应用现状
3.1手术术后应用
在宫颈癌方面，董若凡等[29]将78例宫颈癌患者分为２组，均行宫颈癌根治术，对照组术中于双侧髂窝留置负压引流管，观察组在对照组治疗的基础上给予铜绿假单胞菌注射液。比较２组术后第１—７天淋巴液引流量及引流时间。结果观察组术后第１—７天淋巴液引流量明显少于对照组，引流时间明显短于对照组。訾聃[30]等试验的观察组术后加用铜绿假单胞菌注射液皮下注射，得到了董若凡等相同的实验结果。
皮下积液是乳腺癌乳房切除术后最常见的并发症之一[31]。产生皮下积液的解剖学因素是丰富的皮下毛细淋巴网和毛细血管网.宋爱琳等[32]选取100例乳癌改良根治术后患者，随机分为两组，对照组常规手术治疗，术后加压包扎，试验组接手术结束后关闭术腔前予以铜绿假单胞菌注射液术中喷洒5ml加术后皮下注射。结果表明试验组切口局部疼痛感、肿胀程度较对照组明显减轻，产生皮下积液的量也明显少于对照组，试验组出现皮下积液的患者创面愈合（积液消失）的时间也较对照组短。马富懿等[33]试验结果也提示局部应用铜绿假单胞菌注射液可明显减少皮下积液的产生，有利于创面的愈合。
梅洁等[34]实验结果提示甲状腺淋巴漏患者联合使用铜绿假单胞菌注射液创面注射可加速淋巴管闭合。
魏涛等研究也说明铜绿假单胞菌注射液在治疗甲状腺癌颈部淋巴结清扫术后顽固性淋巴漏方面表现较好[35]。在膀胱癌术后患者中，谢欣、王健等[36-37]研究表明铜绿假单胞菌注射液膀胱灌注能更有效、更安全的预防膀胱癌复发,不良反应少,耐受性良好.
朱继庆等[38]在对恶性胸腔积液和心包积液的治疗的研究中，将铜绿假单胞菌注射液2～5ml和地塞米松5mg,2%利多卡因10ml注射至中心静脉导管中，夹毕48h后再开放引流管，结果评估20例恶性胸腔积液患者中有效率90%，10例恶性心包积液患者中有效率100%。
3.2在新辅助化疗及辅助化疗中
铜绿假单胞菌注射液可被用于乳腺癌的辅助治疗之中，不仅可以延长患者的无病生存期，还可以减少恶性胸腹水[39-40]。毛启新等[41]拟评估其对乳腺癌新辅助化疗方面的有效性和安全性，共选取了40例患者，两组患者采用相同化疗方案，试验组加用铜绿假单胞菌注射液，治疗完成后结果表明其可以提高乳腺癌的总缓解率，改善患者的免疫功能，是较为理想的恶性肿瘤辅助治疗药物。周丹[42]、王晓文[43]等实验也得出其能明显提高新辅助化疗对局部晚期乳腺癌得疗效且安全性良好的结论，并且说明铜绿假单胞菌注射液可以提高患者细胞免疫力。
在直肠癌新辅助治疗中[44]，其能增加化疗药物疗效，减少骨髓抑制的发生；在肝癌[45]及胃癌[46]的辅助治疗中，铜绿假单胞菌注射液腹腔灌注可明显降低肿瘤转移率，对腹水的局部治疗十分有效，且毒副作用轻微，多数可自行缓解。
3.3在放疗方面
王向前等[47]收集66例乳腺癌术后患者，对照组常规放疗，实验组加用铜绿假单胞菌注射液局部注射，实验结果提示铜绿假单胞菌注射液联合放射治疗较单纯放射治疗能提高乳腺癌术后复发的局部控制率，且毒副反应轻微。柳晓咏等实验[48]也得出同样类似的结论
3.4在免疫方面的影响
张仲苗等[49]通过体外实验方法得到了铜绿假单胞菌注射液可以增强淋巴细胞的免疫功能的结论；董哲[50]在结肠部分切除的大鼠中得到铜绿假单胞菌注射液可提高机体免疫状态,降低吻合口漏的发生,减少围手术期死亡率的实验结果；陈赛英[51]在铜绿假单胞菌注射液在卵巢癌辅助化疗方面的研究中、杨彦卓等[52]在非小细胞肺癌的研究中均得到其联合化疗药可提高患者细胞免疫功能的结论。
综上所述，PA-MASH一方面可通过调节树突细胞及Toll样受体调节机体免疫，提高机体免疫系统对肿瘤的抵抗作用，另一方面可以抑制VEGF及EGFR,减少肿瘤细胞的生成，改变肿瘤细胞的耐药情况，而且还可以阻断多种癌症的细胞增殖周期，诱导细胞凋亡。故而在临床中应用范围较为广泛，常联合手术或放化疗，使用方式多样化，例如术中直接喷洒或膀胱灌注、腹腔灌注、引流管注射等，不仅仅局限于说明书中的上臂皮下注射一种使用方式。相信在不久的将来，PA-MSHA可被用作治疗癌症的新候选药物。通过充分开发及利用微生物制品希望，我们可以成功地抑制肿瘤生长，逆转其发展。
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