徐秋语
西安交通大学医学部 710061
【摘要】本方法以快速法医学应用为目标，运用最为常见可操行性强的分离纯化优势菌种及革兰氏染色技术检测大鼠死后不同温度下细菌在不同脏器的到达时间及演替变化，同时应用VITEK-32型全自动微生物分析仪进行菌种鉴定，分析其菌群组成，并运用双脱氧法测序（又称Sanger测序）技术分析，测定细菌、真菌等微生物特异 性标志物，挖掘不同条件下腐败过程中微生物种类及丰度差异，分析微生物群落多样性信息，以期探索死亡时间的新方法，为死亡时间鉴定提供新的方法和思路[1]。
【关键词】死亡时间 微生物 测序 大鼠
0 引言
死后间隔时间又称死亡时间（postmortem interval, PMI)，是指死后所经历的时间，即发现、检查尸体距死亡发生的时间间隔[2]，准确推断PMI，在划定侦查范围、提供侦查线索、确定犯罪嫌疑人有无作案时间、阐明作案过程及案件性质等方面均有重要意义。传统死亡时间推断方法多基于死后尸体现象，如尸斑、尸冷、尸僵等，但 是根据死后尸体变化规律进行推断受鉴定人的主观因素，经验水平的影响，往往不准确可靠。 到目前为止，国内外法医学者为准确推断 PMI 已经尝试了各种研究方法，如应用物理学、化学、微生物学、生物化学、组织细胞化学、昆虫学及分子生物学等，研究尸体 各种指标变化，提出了多种推断早期和晚期 PMI 方法与模型，获得了许多有意义的研究结果，但由于推断 PMI 受到很多体内外条件如环境因素、个体差异、死亡原因等因素的干扰，使得精确推断 PMI 长期成为困扰法医学界的重大疑难课题，尤其是晚期 PMI 推断 [3]。
自然环境中微生物几乎无处不在，无论是活体还是尸体，微生物均会 形成种类庞大而复杂的群落。 有研究表明：在腐败过程中尸体微生物的群落结构会发生极大的改变，而这种时序性变化可作为一种“生物计时器”，可以为PMI的推断提供可靠依据[4-5]。过去数十年，微生物学家利用培养法[6]、微平板分析法[7]、磷脂脂肪酸法[8] 等了解环境微生物结构，本实验应用微生物培养鉴定、Sanger 测序及生物信息学分析方法，探究尸体降解过程中，内部脏器细菌群落到达及演替规律，以期筛选出一些对早期死亡时间推断有意义的优势菌群。从而解决PMI推断的难题[9]。
但是，死亡时间推断受环境温度湿度等影响较大，在死亡时间推断的综合参数法中应考虑到不同地理、不同气候等因素的影响。因此不同地理条件下应有不同的死亡时间推断公式，甚至在同一地区不同季节也应有相对应的方法[10]。同时微生物群落演替规律也受到多种环境因素（温度、湿度、光照等）影响。本研究应用人工气候箱严格控制环境温度，探究不同温度条件下，尸体脏器中微生物群落演替规律，以期为实际案例死亡时间推断提供新的方法和思路。
实验材料
1.1实验动物选择
选择同一实验室同样喂养条件的若干SPF级雄性大鼠，体重应控制在差距小于5g范围内，以防止不同发育程度的大鼠体内微生物的演替情况不同。
1.2实验试剂和仪器
小鼠解剖器械、恒温箱、托盘、平板培养基、厌氧袋、接种环（针）、培养箱、染色剂、测序仪、微生物分析仪。
2.实验方法
2.1总体路线
.png)
2.2实验方法
2.2.1动物分组
将120只大鼠随机分为8个高温组（37℃死后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样组）、8个春秋季昼夜均温组（16℃死后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样组）、8个夏季昼夜均温组（28℃死后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样组），每组4-6只[10][11]。
2.2.2取材
分组结束后，将对照组小鼠脱颈椎处死。严格遵守无菌操作规范进行尸体解剖，无菌采取小鼠死后不同时间的心肌、肝、脾、肾、肺、脑、胃、肠等脏器接种于鲜血琼脂平板, 分别以有氧/无氧条件、37℃培养24h,挑取平板上单个菌落作纯培养。用24h鲜血平板、血清肉汤的培养物,分别作革兰氏染色,并观察其形态并计数。其余各组小鼠尸体同样进行如上操作[12]。
2.2.3平板培养
2.2.4微生物计数
常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。蘸取长出的菌落进行涂片，革兰氏染色后显微镜下观察。分离纯化优势菌种后，用VITEK-32型全自动微生物分析仪进行菌种鉴定[13]。
2.2.5革兰染色
2.2.6Sanger测序
第一步：加入bigdye试剂（包含四种带荧光标记的ddNTP、四种dNTP、DNA聚合酶、镁离子、ph缓冲液等。）进行聚合反应。
在进行聚合反应时，有可能结合上ddNTP且终止反应，也有可能结合上正常dNTP正常反应，直到结合上ddNTP终止反应。反应结束生成长短不一的含有荧光标记的DNA片段混合物（荧光颜色（代表的碱基）与模板的碱基有互补对应的关系）。
第二步：过滤混合物，去除ddNTP等其他杂质，只留下长短不一的DNA片段。
第三步：上机测序：
先在长的中空的玻璃毛细管中注入丙烯酰胺溶液，用紫外光照射丙烯酰胺溶液发生聚合反应变成聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶对于在其中电泳的核酸有分离作用,短的片段在其中电泳得快，长的片段在其中电泳的慢。
把DNA片段混合物，加到有聚丙烯酰胺凝胶的毛细管的一段，在毛细管的两端加上高电压，DNA片段就在电场的作用下，从负极向正极电泳。
在毛细管正极的末端，用激光进行照射，并用分光的光学传感器把不同颜色的荧光强度记录下来。每个DNA片段在经过激光点扫描时，它上面带有的荧光基团就会发出特定颜色的荧光。峰越高、越尖，与别的峰的交错越少，则这个碱基判读准确性越好。
预期结果：
经过上述方法，可以得到大鼠死后不同温度下细菌在不同脏器的到达时间及演替变化以及优势菌种，由此可反推某一脏器的细菌来自于何时死亡的机体，完成死亡时间的推断。
参考文献：
[1]ALAN G，SARAH J P. Microbes as forensic indicators[J]. Trop Biomed，2012，29（3）：311-330.
[2] 丛斌.法医病理学[M].5版.北京：人民卫生出版社 ，2016：70.
[3]杨安顺，权国林，高云贵等 尸体肛温与死亡时间推断 广州市公安局海珠区分局，广东 广州 520290 中山大学中山医学院法医学系，广东 广州 520080? Journal of forensic medicine,December 2019,Vol.35,No.6
[4] METCALF J L， WEGENER PARFREY L， GONZALEZ A， et al. A microbial clock provides an accurate estimate of the postmortem interval in a mouse model system[J]. Elife，2013，2：e1104.
[5]江鑫钰,王江峰,朱光辉,马孟云,赖跃,周晖.Biolog-Eco法检测尸体微生物群落的代谢功能变化[J].法医学杂志,2016,32(03):171-175+179.
[6] HEIMESAAT M M， BOELKE S， FISCHER A， etal. Comprehensive postmortem analyses of intestinal microbiota changes and bacterial translocation in human flora associated mice[J]. PLo S One，2012，7（7）：e40758.
[7] 江鑫钰，王江峰，朱光辉，等. Biolog-Eco法检测尸体微生物群落的代谢功能变化[J].法医学杂志，2016，32（3）：171-175，179.
[8]刘琨毅,王琪,周书来,吴冬梅,龙治国. 基于磷脂脂肪酸剖析不同老熟方法的窖泥微生物群落结构[J].中国酿造,2019,38(01):134-139.
[9]符晓亮,郭娟娟,刘卓鹰,沈肖,蔡继峰.高通量测序在尸体微生物及死亡时间推断中的应用[J].法医学杂志,2018,34(05):475-481.
[10]郝尔娃. 小鼠死后环状RNA CDR1as、Rims2、Dym表达量与死亡时间的相关性研究[D].青海大学,2019.
[11]翟园. 西安地区降水和温度变化特征研究[D].兰州大学,2014.
[12]陈科.药物毒性病理学中脏器取材标准方法研究[J].中国畜牧兽医文摘,2015,31(09):67.
[13]刘茜. 腐败微生物及腐败产物检测推断死亡时间的研究[D].华中科技大学,2009.