朱军
（江苏省省级机关医院、江苏省老年病医院(南京医科大学附属老年医院)心血管内科；江苏南京210024）
摘要
本研究在于探讨PRKCH基因过表达对脂蛋白a (Lpa) 水平，载脂蛋白B100(apoB100)以及低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor，LDLR )，RP1-13D10.2水平的影响，探讨PRKCH与胆固醇代谢的关联性。结果研究表明PRKCH基因过表达后出现Lpa水平上升 (P=0.032)，apoB100及LDLR水平下降 (P=0.039，P=0.030)，RP1-13D10.2水平上升（P=0.04）。PRKCH基因过表达后显著影响了巨噬细胞中Lpa，apoB100，LDLR，RP1-13D10.2的转录水平(P<0.05)。
关键词: PRKCH；脂蛋白a；载脂蛋白B100
引言
PRKCH作为PKC家族的一员调控CTLA-4-介导调节性T细胞功能[1]。目前研究显示PRKCH基因与动脉粥样硬化性疾病相关[2-3]，而Suzuki[4]观察到PRKCH可以调节血脂代谢，部分研究则表明PRKCH在Lpa代谢中起到重要的作用[5]，而脂蛋白a(Lpa)与冠状动脉粥样硬化性心脏病密切相关[6]，Wheeler E等[7]阐述了PRKCH 基因突变与早发肥胖具有相关性。这些均提示PRKCH与血脂的关联性。我们先前的研究证实了PRKCH基因突变与冠心病的发病风险及LDL水平密切相关[8]，这为PRKCH与血脂代谢具有相关性提供了依据, 然而其中的机制不明确，因此目前有部分研究围绕其中的原因有一些文献报道, 据Torisu K[9] 在Apoe基因敲除的小鼠中观察到敲除PRKCH 基因可以改善包括TC，TG，HDL以及LDL在内的血脂代谢及并最终降低了动脉硬化风险, 这进一步验证了PRKCH基因在血脂代谢以及动脉硬化发病中的作用，正如作者在该研究中指出一样，关于PRKCH是具体如何影响TC，TG等血脂指标，因此本研究的目的在于探讨其中的机制。先前研究显示MYLIP基因的rs6924995位点位于长链非编码RNA RP1-13D10.2区域，通过对rs6924995进行干预研究，结果显示可影响RP1-13D10.2水平，最终对LDLR、LDL及apoB等水平均有影响[10]。为了实现这些目标，于是我们在巨噬细胞中完成了PRKCH 基因过表达，观察对诸如Lpa，apoB100，LDLR等水平的影响。
材料与方法
实验材料和方法
构建PRKCH基因的重组腺病毒载体（Ad-PRKCH）和阴性对照组（Ad-GFP），并转染，培养巨噬细胞RAW264.7，研究分为Ad-PRKCH组和Ad-GFP组，RAW264.7巨噬细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，12h后，分别用同体积的Ad-PRKCH和Ad-GFP转染、培养细胞48h。实验实施前，各组细胞进行饥饿24h，利用100μg/ml的OX-LDL干预细胞48h后可转化为泡沫细胞，并收取标本检测，油红O染色检测两组细胞中Lpa水平，以β-actin作为内对照，Western blot检测apoB100，LDLR表达。RT-PCR方法检测两组apoB100及LDLR的mRNA水平。
统计学分析
各组数据均以mean±SD表示，符合正态分布的计量资料采用t检验组间数据比较，数据处理使用SPSS18.0完成统计学分析，P<0.05为有统计学差异。
结果
利用不同感染复数的Ad-GFP感染鼠源性RAW264.7巨噬细胞48h后，使用荧光倒置显微镜系统观察Ad-GFP的蛋白表达，结果显示，随着感染复数值的升高，荧光强度逐渐增加，提示病毒的转染效率相应增加。
与PRKCH基因正常表达组（Ad-GFP）相比，PRKCH基因过表达后（Ad-PRKCH）的巨噬细胞中的Lpa水平均上升，而apoB100及LDLR水平均出现下降。
此外我们对转录水平的进一步的研究，结果显示PRKCH基因过表达的巨噬细胞中apoB100，LDLR的mRNA均有显著性下降，同时RP1-13D10.2水平上升（P=0.04）。
讨论
本研究是目前首次探讨PRKCH基因过表达后对Lpa，apoB100以及LDLR，RP1-13D10.2的影响，结果我们的研究表明PRKCH基因过表达后，无对冠心病的重要危险因素Lpa，还是对LDL代谢途径中重要因素apoB100，LDLR及RP1-13D10.2均有显著性影响。
PRKCH 的过度表达会增加细胞增殖[11]。apoE缺失的人和小鼠会导致TC，LDL和VLDL水平上升，LDLR作为血浆中重要的TC运输蛋白，LDLR可以通过与apoB和apoE结合，介导LDL和VLDL的清楚，起到调节TC等血脂的作用。Torisu[12]在他们的动物实验中证实沉默PRKCH基因可以改善血脂代谢，但是至于如何影响血脂代谢，他们没有给出具体的原因。Lara[13]研究显示PRKCH负向调节LDLR水平，而LDLR众所周知对于LDL，Lpa代谢至关重要，因此PRKCH可能最终通过LDLR影响LDL及Lpa水平，但是目前还没有相关的研究报道。我们先前的人群研究显示PRKCH基因突变可以影响LDL水平，而与LDL结构类似的Lpa同样是动脉粥样硬化性疾病重要的危险因素，因此我们在巨噬细胞实验中验证PRKCH基因过表达后对Lpa是否有影响，结果显示PRKCH基因过表达后会显著影响Lpa的水平。有研究显示PRKCH与活性氧密切相关[14]，Lpa与活性氧具有关联性[15]，因此PRKCH可能通过活性氧影响了Lpa水平。大量的研究均显示体内的LDL及Lpa均通过LDLR及apoB100最终分解，因此我们对PRKCH基因过表达后LDLR及apoB100的水平进行了探讨, 结果显示PRKCH基因过表达后LDLR及apoB100水平无论在蛋白水平，还是在mRNA都有显著性变化。
致谢
本研究得到江苏省老年病医院(南京医科大学附属老年医院)院级课题(编号L201701)及江苏健康职业学院课题(编号JKB201721)资助。
参考文献
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