李玥
辽宁师范大学
摘要
近年来多肽分子的自组装已经逐渐成为材料学和生物医学等领域的研究热点。由于多肽分子具有相对较好的可控性和生物相容性。因此，利用多肽分子自组装构建各种具有功能性的材料载体应用于药物装载、释放等领域有着巨大的应用前景。并且目前基因治疗作为一种解决人类疾病的潜在有效方法同样受到广泛的关注。其中设计并合成出转染效率高、基因容量大、免疫原性较低、细胞毒性较小的基因递送系统是基因治疗的关键。本文介绍了多肽分子的自组装应用于构建基因递送体系，并且总结了利用多肽分子自组装介导基因递送的机制，包括利用多肽分子自组装介导外源DNA进入细胞质转运机制、以及进入细胞核转运机制，并进一步阐述多肽自组装材料学和生物医学等领域里的应用。
关键词：多肽；自组装；基因治疗
1 引言
分子自组装是分子与分子之间或分子中的某一片段与另一片段之间的分子识别，通过非共价键的相互作用使体系中的分子在空间、尺度上的分子重排与堆积，从而形成具有一定特殊排列顺序的分子聚集体的过程[1]。而多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质,介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成[2]。由于不同的多肽链往往氨基酸的数量、种类以及排列顺序各不相同，所以可以通过分子设计并合成出结构特异、具有不同功能的多肽分子，从而使多肽链之间可以利用其氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用以及疏水作用等完成分子自组装的效果，实现有效的多肽分子自组装以及自组装条件的优化[2]。由于多肽分子相对于其他自组装体系具有较好的可控性和生物相容性，因此多肽分子的自组装有着广泛的应用前景，尤其是在基因治疗、组织工程等生物医学领域[3-8]。本文将从多肽-DNA分子结构自组装、脂质-多肽-DNA超分子结构自组装的应用实例逐一阐释利用多肽分子自组装介导基因递送的机制以及应用。
2多肽分子自组装在基因递送中的应用
2.1多肽-DNA分子结构自组装
Xu等[9]设计合成出以赖氨酸端基的球型树状多肽聚合物和带有一个谷氨酸残基的聚L型亮氨酸的多肽通过两步自组装而构建的纳米颗粒(图1)。目前对于多肽分子在基因递送中的应用，细胞穿透肽已被证明是一种有效的基因载体，可以传递各种无法直接穿透细胞膜的分子，例如DNA，siRNA和蛋白质等。但是如果将该方法应用于体内基因递送治疗，则有一定的缺点。常规的单链细胞穿透肽进入到细胞中，通常会遭受蛋白酶降解，从而使结构遭到破坏，甚至是被快速的清除降解。 所以Xu，DeRidder等[10]从头设计并合成出阳离子多结构域肽（MDP）通过多肽分子自组装，形成超分子组装结构，包裹外源基因完成基因递送，这样不但降低多肽分子被体内蛋白酶的降解，还在一定程度上，提高了基因递送的效率。针对囊性纤维化疾病的治疗，开发安全有效的非病毒载体一直是研究的重点与难点，虽然常规的阳离子聚合物以及脂质体在囊性纤维化基因递送治疗上有一定的功能。但是应用于体内基因递送治疗，往往效果不佳。所以Guan等[11]利用多肽分子的自组装与泊洛沙姆及其乙二胺衍生物和外源基因可以自发形成紧密的单分散纳米颗粒。实验证明泊洛沙姆及其乙二胺衍生物对于体外基因递送基本无效，而在体内基因递送效率，与病毒载体相比也比较低。而多肽-泊洛沙姆及其乙二胺衍生物形成的纳米粒子介导基因递送效率无论在体外还是体内均有提高。并且多肽-泊洛沙姆及其乙二胺衍生物纳米颗粒具有安全的整合特性以及稳定性。Tandon[12]发现人类TLR4衍生的20个残基的多肽（TR-433），可以发生自组装形成纳米结构。同时TR-433还可以诱导被TLR4/CD14/MD2瞬时转染的THP-1单核细胞以及HEK293T细胞发生促炎反应[12]。并且基于TR-433的自组装以及促炎特性，TR-433还可以作为疫苗的成分，增强宿主免疫系统对抗原的识别，从而刺激其免疫应答。Dowaidar M[13]等发现将磁性纳米颗粒（MNPs，Fe3O4）掺入细胞穿透肽（CPPs）-寡核苷酸（ONs）自组装形成的复合物，与细胞穿透肽-寡核苷酸（CPPs-ONs）的转染效率相比，具有更高的转染效率。
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图1 Xu等[9]设计的以赖氨酸端基的球型树状多肽聚合物和带有一个谷氨酸残基的聚L型亮氨酸的多肽两步自组装过程图
2.2脂质-多肽-DNA超分子结构自组装
基因递送的效率主要取决于基因载体的性能以及外源DNA与载体间的相互作用。目前对于阳离子脂质复合物已经广泛应用于基因转染中。但是脂质复合物将外源DNA递送到细胞后，递送的DNA容易受到细胞内化的限制。所以Rea JC等[14]认为要想克服这一缺点，需要通过改变基因载体与外源DNA的相互作用。他们利用阳离子多肽的自组装对脂质复合物进行修饰（图2），研究其转染效率。他们发现相对于单独的脂质，多肽-脂质复合物转染效率提高了4.6倍。并且细胞内溶酶体对外源DNA的降解降低了2.1倍。阳离子脂质与阳离子肽和DNA载体的组合可在基因递送中产生协同作用[15]。Kang JH[16]等将磷脂-聚乙烯亚胺共轭物的纳米颗粒基因递送载体改造。利用富含精氨酸的Nonaarginine替换毒性较强的聚乙烯亚胺从而构建毒性较小的载体系统。然后通过自组装方法构建携带寡核苷酸与脂质-肽杂合纳米颗粒。他们研究发现该体系的基因递送系统对细胞毒性较小，并且对外源DNA的负载效率高[16]。以荷瘤小鼠为研究对象，实验结果显示出该基因递送系统的细胞摄取和转染效率较高，且细胞毒性较小。一般情况下，阳离子脂质体与阳离子多肽更容易与siRNA通过静电作用而发生自组装的效果，从而在体外实验中实现有效的基因转染和基因沉默。所以Tagalakis[17]等开发了利用阴离子聚乙二醇化脂质体-阳离子靶向肽-siRNA纳米复合物。实验表明，在最佳组分比例下，该基因递送系统在血清蛋白存在下对聚集具有抗性，并可以实现了基因沉默的效果。目前在开发用于体外和体内基因递送的多种制剂中已经取得了很大的进展，包括脂质-多肽-DNA（LPD）[18]。此外，还有人提出可以利用天然组蛋白-DNA复合物与阳离子脂质组合形成复合物[18]，这也为基因递送提出潜在途径。
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图二 Rea JC等[14]设计脂质-多肽-DNA超分子结构自组装过程图
3 利用多肽分子自组装介导外源DNA进入细胞质转运机制
3.1多肽分子与外源DNA复合物的形成
当外源DNA被成功地递送到宿主细胞后，那么下一步就是要通过细胞质进入细胞核，完成基因的复制、转录与翻译。但是在细胞质中含有一些核酸酶，会降解游离的DNA。有研究表明，当DNA被转运到HeLa细胞后，半衰期只有50-90 min[19]。所以利用多肽分子自组装介导外源DNA的基因递送，可以提高转染效率。Xu等[9]发现利用赖氨酸端基多肽和带有一个谷氨酸残基的聚L型亮氨酸的多肽自组装完成基因递送，多肽分子与外源DNA分子形成复合物需要大约20分钟。而对于脂质-多肽-DNA超分子结构自组装，则较为复杂。Rea JC等[14]选择Lipofectamine-多肽-DNA作为基因递送体系，其中Lipofectamine与DNA的质量比例为10：1 。制备复合物方法先用构建多肽-DNA复合物体外孵育20分钟，再滴加脂质溶液体外孵育20分钟。
3.2 外源DNA在宿主细胞细胞质中的转运
即使外源的DNA通过基因递送系统运输进入细胞质，但是形成的膜泡或网格蛋白只能作为细胞内吞途径的一个区室[20]。由于有细胞骨架形成的胶质网络存在，外源DNA都无法准确地传递到相应靶点[20]。因此虽然基因递送系统可以作为转染的载体，提高转染的效率。
研究表明，细胞质中的生物分子可以被快速地溶解与分散，也可以根据其定位信息如信号肽的介导，完成在细胞质中的识别与运输[21,22]。有实验证明一些小分子量的外源DNA能溶解在宿主细胞的细胞质中，而对于分子量大于2000bp的外源DNA只能一部分溶解于细胞质中，不能完全溶解[23]。这是由于细胞质中存在由微管、微丝以及中间纤维组成的细胞骨架，它们交错在一起形成胶质网络。事实上，外源DNA在进入细胞质以后是通过微管网络以及其马达分子动力蛋白运输的。例如，带有GFP荧光蛋白基因的质粒pEGFN1进入宿主细胞会有超过600种蛋白参与其组装成蛋白质与质粒DNA复合体[24]。其中有些蛋白质与质粒DNA的结合是非特异性的，并且通过微弱的静电作用相互结合，目的是为了保护质粒DNA不会被核酸酶降解，还有一些蛋白质与质粒DNA的结合是特异性的，目的是为了帮助质粒DNA的转运[24]。还有研究表明，微管是直接驱动外源DNA在细胞质中运输的载体，而微丝对于外源DNA在细胞质中的转运几乎没有影响[25]。以TC7 cell为研究对象，选择显微注射的方式将带有GFP表达基因的质粒DNA注射进入细胞质中[25]。正常情况下，未经过其他处理，该细胞可以表达GFP；但是如果对已经注入质粒DNA的细胞进行微管抑制剂诺考达唑处理，那么该细胞几乎不表达GFP[25]。这是由于诺考达唑作为微管抑制剂，会促使细胞中的微管网络解聚，这样质粒DNA在细胞质中将无法正常转运。但是如果对已经注入质粒DNA的细胞进行肌动蛋白抑制剂处理，那么该细胞可以表达GFP，并且GFP的表达量与未经过处理的细胞几乎相同[26]。这说明肌动蛋白抑制剂并不能抑制质粒DNA在细胞质中的转运。那么以肌动蛋白为结构蛋白的微丝对质粒DNA的转运没有明显影响[26]。因此，在外源DNA转染实验中，细胞骨架微管介导的转运系统是很重要的。
4 利用多肽分子自组装介导外源DNA进入细胞核转运机制
4.1外源DNA的细胞核转运
目前研究表明，外源DNA能否穿透核被膜是细胞转染实验的成败关键之一。Capecci[27]在1980年的实验中证明一般情况下外源DNA不能直接通过核被膜。当外源DNA通过显微注射的方法注射到细胞质中，几乎所有的受试细胞均无明显的外源基因表达现象；但是当外源DNA被注射到细胞核中，大概有50%-100%的受试细胞出现了外源基因表达的现象。即使外源DNA可以进入细胞核，但是数量也非常少[27]。比如，将参与转染实验的质粒DNA的数量严格控制，当将2000-10000个质粒DNA通过显微注射的方式分别运送到同种细胞的细胞质中，分别经过24-36小时孵育，只有大约20-100个能够进入细胞核[28,29]。因此，设计并合成出提高外源DNA转染效率的基因载体尤为重要。
4.2 SV40 T抗原核定位序列引入多肽分子介导DNA细胞核转运机制
基于外源DNA几乎无法直接进入细胞核，所以Rea JC[14]提出可以选择将SV40 T抗原引入多肽分子中，利用脂质-多肽分子自组装包裹外源DNA将基因递送到细胞核。SV40又称猿猴病毒40，是在人以及猴中发现的一种致瘤病毒。[30,31]SV40病毒的基因组包括一个环状双链DNA。早期SV40病毒在侵染宿主细胞时，SV40病毒基因编码在宿主细胞中产生两种肿瘤抗原称为T抗原。因T抗原的分子量的不同，分为大T抗原，分子量为94000；与小T抗原，分子量为17000。而这两种抗原会完成宿主细胞的转化以及肿瘤的发生。其中大T抗原相对与小T抗原对于细胞转化更为重要[14,30]。大T抗原是细胞转化必需的，宿主细胞维持其表型稳定需要大T抗原的连续表达。小T抗原对于SV40病毒侵染细胞转化的影响不是有无的关系，而是起到了增强转化能力的作用[30]。他们利用SV40 T抗原核定位序列（NLS）引入肽段中，通过自组装与外源DNA形成复合物[14]。研究表明，与没有引入SV40T抗原核定位序列多肽的脂质复合物相比，DNA的核积累效率提高了3.0倍。
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