1.李赫2.李坤朗 3.李光磊
2.1.华北理工大学药学院 河北唐山 063000 2.华北理工大学 药学院 河北唐山 063000 3.华北理工大学 口腔医学院 河北唐山 063000
CCAT2是在rs6983267区域发现的长非编码RNA，相关研究发现CCAT2不同基因型表达比例与肿瘤转移活性相关。由于CCAT2的不同基因型对肿瘤的发生起着重要的作用，而它的检测方法尚欠缺，还没有一种既经济又精确的检测手段。故本课题拟应用通用的分子生物学手段，建立一种定量检测CCAT2不同基因型的方法，为CCAT2的临床检测以及基础研究提供有力的手段；同时为单碱基差异核酸定量研究方法的建立提供实验数据。
采用末端引物检测法、探针检测法、数字PCR方法建立定量检测CCAT2中不同基因型的方法。实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具。数字PCR是一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室，PCR扩增反应后，对荧光信号进行检测分析，实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度。本文介绍几种不同方法的区别，着重阐述这几种方法在检测CCAT2的G/T基因型及其含量中的应用，为CCAT2的G/T基因型的检测提供更为精确、经济的手段，从而为单碱基差异核酸定量研究提供实验数据。
CCAT2 是在rs6983267区域发现的长非编码RNA。长非编码RNA (Long non-coding RNA, LncRNA)一般指长度大于200个核苷酸的非编码RNA。非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)如miRNA、siRNA等，在生物生长发育过程中发挥着重要的作用，已经成为现阶段研究的热点。越来越多的研究表明，长非编码基因CCAT2在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。如长非编码RNA CCAT2可以促进胃癌细胞的增值和侵袭，促进乳腺癌细胞的生长和转移，调节肝癌细胞的增值、迁移和凋亡。全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)研究表明，位于8q24 的rs6983267 的SNP与结肠癌发生高度相关。
后续的研究发现，在不同人种以及不同疾病背景下，rs6983267不同的基因型与肿瘤发生相关：如Cussenot等研究认为rs6983267与肿瘤侵袭无关，但与家族性肿瘤相关；Sun J等的相关研究的发现表明，在不同的种族间大概存在着差异；在甲状腺癌的研究表明[，以往被认为的危险因子G是隐性的，而不是通常认为的显性；在我国胃癌人群的研究发现GT杂合型是危险因素；有趣的是，在糖尿病发病的结肠癌病例对照研究中发现，结肠癌的发生与基因型TT相关。这表明，不同的等位基因都可能与疾病的发生相关，并与不同的种族以及疾病背景相关。
综上所述，CCAT2的不同基因型对肿瘤的发生起着重要的作用，而它的检测方法尚欠缺，还没有一种既经济又精确的检测手段。故本课题拟应用通用的分子生物学手段，建立一种定量检测CCAT2不同基因型的方法，为CCAT2的临床检测以及基础研究提供有力的手段；同时为单碱基差异核酸定量研究方法的建立提供实验数据。
目前，对于基因型的不同检测方法大概有以下几种：全基因组测序、限制性内切酶Tsp45I与PCR联用的方法、Taqman探针方法、实时荧光定量PCR方法、数字PCR方法。这几种方法都有各自的优缺点。目前，全基因组测序是对已知基因组系列的物种进行不同的个体的全基因组的测序，经过数据分析后序列进行拼接、组装并获得基因组图谱，或是对不同组织进行测试并分析体细胞突变的一种研究方法。由于人类基因组过于复杂，要借助于全基因组测序进行全基因组检测很难到达所需要的测序深度。因而，需要重复测试和双端测试，由此造成测序费用的进一步升高。此外，由于不能达到足够的测序深度，使得测试结果准确性降低，而对于临床疾病诊断和普通科研工作，其高昂的检测费用也是难以承受的。限制性内切酶Tsp45I与PCR联用的方法相比全基因组测序具有廉价的优点，且操作技术相对简单，通过对酶切位点的检测，就可区分不同的基因型，但无法做到精确定量，且操作过程过于繁锁。Taqman探针方法与限制性内切酶Tsp45I与PCR联用的方法相比，具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点。Taqman探针方法可以根据需要设计标记探针，对不同的基因型进行精确的检测。但是采用Taqman探针方法需要购买试剂盒产品，定制探针的费用很高，使得成本升高。探针法是实时荧光定量PCR技术的其中一种，此外还包含荧光染料法。实时荧光定量PCR技术利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效，高通量，而且高敏感性等特点，该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。数字PCR是在实时荧光定量PCR方法之后发明的，相对于Taqman探针方法所需成本相对低。与染料法相比，数字PCR具有高灵敏度，高精确度，高耐受性和绝对定量的优点。