胡志恒 安凤伟
中冶南方城市建设工程技术有限公司，湖北 武汉 430070
[摘要]分别采用磷脂法和流式细胞仪对生物滤池滤料表面的生物量进行测定，采用TTC-脱氢酶法测定其生物活性，分析了生物量、生物活性沿水流方向的变化规律，同时探究了生物滤池对TOC的沿程去除效果。结果表明：流式细胞仪与磷脂法测得的生物量相关性良好，二者具有较好的一致性，其在生物滤池进水端分布广泛，而在出水端稀少，同时生物量、生物活性的大小沿水流方向均呈现明显的下降趋势。TOC沿水流方向沿程递减，其受生物量、生物活性的大小影响较大，同时TOC的去除主要发生在进水端22cm的范围内，而在22cm~92cm范围内有机物的去除效果不明显。
关键词：生物滤池；生物量；磷脂；细胞数；生物活性；
An experimental study on biological characters and purifying efficiency in drinking water biofilter
Hu Zhiheng,
(School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Wuhan 430223, China)
Abstract：The biomass were determined by the methods of phospholipid and the population of cell, Viable microbial activity was determined by dehydrogenase activity,and spatial viability of biomass and microbial activity with meida height were measured in the reactor. The removal efficiency of TOC at different filter depths was also studied. The result indicates that the distribution of biomass and microbial activity were not even. Biomass and microbial activity tend to decrease with the upflow current. Near the inlet, a large proportion of biomass was included in the lower 22cm of the media. The biomass and microbial activity has significant effect on organic carbon concentration, during the period of stable operation, TOC decreased along with the filter bed, about 53% of TOC was biodegraded at the depth of 22cm of media, no further removal was seen as the deeper bed layers.
Keywords：biological filter; biomass; phosphlipid; the population of cell; microbial activity;
近年来利用生物滤池处理微污染水源水已成为给水处理中的研究热点，生物滤池对微污染物的降解主要通过附着生长在填料表面的微生物来完成，其中微生物的生物量和生物活性对反应器的处理效能起着至关重要的作用，是表征生物特性的两个重要参数。因此如何快速、准确、简便地测定生物滤池中微生物的生物量与生物活性，对于研究生物滤池中微生物的特性具有重要意义。目前在饮用水生物处理中，对于微生物活性的测定已相对成熟稳定，常用的检测指标有TTC-脱氢酶活性，ATP含量以及OUR[1]；而生物量的测定，其方法众多，主要有平板计数法和磷脂法，以脂磷法应用最为广泛。但这两种方法均存在测样时间较长（大于24h）的明显缺点，同时Siebel等[2]发现自来水中的微生物仅有0.001%~2%的细菌可以通过平板进行培养，于鑫[3]等也发现通过平板计数法测得的生物量仅为磷脂法所测生物量的0.70%~5.75%，可见平板计数法测定的生物量数值并不真实、准确；而磷脂法实验操作繁琐，须使用对人体有毒性的氯仿。本试验同时采用磷脂法、流式细胞仪对生物滤池中生物量进行测定分析，采用TTC-脱氢酶法测定生物滤池滤料上微生物的活性，为生物滤池中微生物的生物特性研究提供参考，同时为生物量的快速、准确、简便测定提供依据。
1 实验部分
1.1 试验装置与进水水质
生物滤池反应器由有机玻璃制成，如图 1所示。反应器高1300mm，直径20mm，承托板以上按级配直接装填8~10mm的砾石，装填高度为80mm，砾石以上装直径1~3mm的页岩陶粒，装填高度为940mm，承托板以上每隔100mm设取样口，取样口编号依次为1、2、3、4、5、6、7、8、9。设计水量Q=5L/d，水力负荷q=0.66m3/(m2·h)。
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根据一般微污染水的水质状况，试验采取配水的方式模拟微污染原水。滤池进水用自来水配制，自来水在配制之前放置24小时以除去余氯，原水水质见表 1。稳定运行期间，生物滤池对原水中的NH4+-N、UV254、TOC 平均去除率分别为66.34%、16.14%、34.18%。
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1.2 试验方法
生物滤池稳定运行时期，沿反应器水流方向不同深度取生物填料与水样，进行生物量、生物活性和TOC的测定。填料表面的生物膜洗脱方法采用超声波剥落，先用超纯水洗去陶粒表面杂质，再用经灭菌的0.01mol/LPBS缓冲溶液2mL浸泡12min，20W低能超声处理[4]，得到微生物膜悬浮液。测量完后再将分析所用陶粒用蒸馏水清洗干净，烘干至恒重后称重。
1.3 分析方法
1.3.1 常规指标
NH4+-N采用纳式试剂分光光度法测定[5]；pH的测定用PHS-3C精密酸度计；UV254的测定采用DR5000分光光度计；TOC的测定采用岛津TOC-LCPN/CPN总有机碳分析仪。
1.3.2 生物量
(1)磷脂法
磷脂的测定方法见参考文献[3]，制作的标准曲线如图2。样品测定结果以nmol P/g填料表示，1nmolP约相当于大肠杆菌(E.coli)大小的细胞108个。
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(2)流式细胞仪
流式细胞仪的基本原理是将待测颗粒(细菌或者哺乳动物细胞)维持在液流状态，然后依次单个通过激发光源(如488nm)，由于待测颗粒自身具有荧光特性或者与染料物质结合后的产物，会显示出荧光特性和散射光特性(前散射光和侧散射光)，从而与非生物颗粒区分。如水中细菌数量测定时，可以利用染料(SYBR Green I，SYTO-9或DAPI)与细菌DNA特异性结合时显示出来的荧光特性和散射光特性与水中非生物颗粒区分，这样可以快速(约10min)准确地测定出水中细菌的数量。该方法测定水中细菌的检测范围为(1×103~2×105) cells/mL，当浓度超过该范围时需要进行稀释。流式细胞仪可快速分析水样的细菌总数[6]、细胞尺寸大小[7]及表征细胞的生理特性(如细菌的活性和DNA含量等) [8]。
测定时取500μL微生物膜悬浮液于具塞离心管中，离心管先经涡旋混合器震动5s，后在DHS恒温金属浴中预热至35℃（5min），然后用10μLmL-1的SYBR Green I(用二甲化砚1:100稀释)染色，在35℃避光条件下培养10min[9]，后用流式细胞仪测定其细菌浓度（cells/mL），根据细菌浓度可以推知微生物膜悬浮液总细菌数，生物量的表示是采用单位干重滤料载体上的细菌数，表示以cells／g计，即单位干重的滤料表面上蛋白质质量。
1.3.3 生物活性
采用TTC-脱氢酶法测定生物滤池滤料上微生物的活性，测定方法见参考文献[10]，制作的标准曲线如图3。TTC-脱氢酶活性的表示是以单位干重滤料载体上的生物活性为单位，表示TTC-脱氢酶比生物活性，以μgTF/(gdw·h)计，即单位时间、单位干重的滤料表面上反应生成的TF量。
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2 结果与讨论
2.1 生物滤池沿程生物量
生物滤池中不同滤层深度的生物量见表2，由表可知，两种方法测得的生物量具有相似的分布，生物量在滤层的不同深度差别较大。在滤层深度2cm处即生物滤池进水端，磷脂法与流式细胞仪所测生物量最高，而在滤层深度92cm处即生物滤池出水端，其所测生物量最低，分别只有进水端的10.02%、14.17%。同时磷脂法与流式细胞仪所测生物量的线性关系良好，其相关系数为0.9832，可见磷脂法与流式细胞仪所测生物量出现了较好的一致性。
磷脂法、流式细胞仪测定生物量沿滤层深度变化曲线见图4，由图可知，两种方法测得生物量具有相似的变化趋势—沿水流方向逐渐降低。生物量从滤层深度12cm处开始大幅度下降，其分布自上而下呈明显的线性递减关系，相关系数分别为0.8897、0.8176。出现上述现象，是因为反应器采用下向流，滤池上层与空气接触充分，溶解氧含量较高，其营养物质条件相对于滤层中下部较好，使得异养菌有充足的养料得以大量繁殖，生物量相对较高。而在滤层中下部，原水中的有机物、溶解氧下降到较低水平，底物浓度和溶解氧缺乏抑制了微生物自身的增殖[11]，导致单位质量填料上的生物量迅速降低。
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2.2 生物滤池沿程生物活性
生物滤池中不同滤层深度的生物活性见表3，由表可知，单位质量填料上生物活性在生物滤池进水端最大，而在出水端最小，且沿水流方向保持递减的趋势。出现上述现象，是因为营养物质大部分消耗在滤层上部，在原水流经滤层中下部后，其含量已下降到较低水平，营养物质缺乏导致此时微生物代谢减弱，生长速率减慢，此时不仅生物量出现较大幅度下降，生物活性也受到了限制。磷脂法、流式细胞仪测定生物量与生物活性的线性关系分别为0.9454、0.9778，线性相关性良好。但生物滤池中生物量高不一定就意味具有较高生物活性[12]，有研究显示单位载体生物膜中微生物的活性除了与微生物量有关以外，还受到水中的溶解氧含量、pH值、水温以及生物处理装置的运行情况等多种因素的影响，所以微生物活性与微生物量在数值上往往不成比例[13]。
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a:平均值±标准偏差 n:测量次数
2.3 生物滤池沿程TOC
稳定运行期生物滤池沿程TOC见图4。由图可知，TOC浓度沿水流方向保持递减的趋势，与磷脂法、流式细胞仪测定生物量、生物活性线性关系良好，相关系数分别为0.7674、0.8518、0.8306，可见有机物浓度受生物滤池的生物量、生物活性大小影响较大，这与朱小彪等人的研究相一致[14]，有机物浓度对于生物量和生物活性的大小有很大影响，有机物浓度较低时会成为微生物生长的限制因子，导致生物量和生物活性都比较低。
进一步分析可以发现，生物滤池对有机物的去除作用主要发生在进水端22cm的范围内，在这段滤层内，反应器对TOC的去除率为52.66%，占总去除率的89.42%，而在22cm~92cm范围内，系统对有机物的去除率仅占总去除率的10.58%。这是由于进水端22cm的范围内，有机物浓度相对较高、溶解氧较充足，微生物大量繁殖，生物量、生物活性均处于较高水平。故在生物滤池进水端，微生物对有机物的生物降解作用非常快，TOC下降迅速。而在原水进入滤层中下部后，有机物浓度已下降到一定程度，同时溶解氧浓度在不断降低，底物浓度和溶解氧浓度成为反应速率的限制因素[15]，导致在滤池22cm~92cm范围内，微生物的生物降解作用受到抑制，有机物的去除效果不明显。
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3 小结
(1)流式细胞仪所测生物量与磷脂法相关性良好，二者具有较好的一致性，其在生物滤池进水端分布广泛，而在出水端稀少，同时生物量、生物活性沿水流方向均呈现明显的下降趋势。
(2)TOC浓度沿水流方向保持沿程递减趋势，其对生物量、生物活性存在较大影响。同时TOC的去除主要发生在进水端22cm的范围内，而在22cm~92cm范围内有机物的去除效果不明显。
参考文献：
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