郭卓璋1 陈亚海 2
（1吴川市振文农业农村服务中心 ；广东吴川；524500 ）
（2吴川市吴阳农业农村服务中心；广东吴川；524500）
摘要：烟台海阳地区某猪场新生仔猪发生了大规模的腹泻，为了判断其发病原因及病原体种类，从该养猪场采集腹泻仔猪粪便及肛门拭子48份，对粪样进行了细菌的分离纯化、革兰氏染色镜检，生化试验，PCR鉴定，血清型鉴定以及药物敏感性检测。结果表明，致病性大肠杆菌感染导致了该猪场发生仔猪腹泻疫情。分离到的菌株血清型为987P型，该菌株对头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星敏感。通过检测为该猪场仔猪腹泻的治疗与防控提供了依据。
关键词：仔猪腹泻；大肠杆菌；分离；鉴定
大肠杆菌是自然界中普遍存在的一种细菌，致病性大肠杆菌能引起温血动物的腹泻，在养殖行业中，主要感染猪，鸡等家畜家禽，而且发病率高，致死率也高，对养殖行业危害非常大。大肠杆菌发病不但与天气有关而且还与动物的粪便有关，所以日常的清理粪便以及粪便的生物热处理非常重要。为了确定烟台海阳某猪场这起仔猪腹泻是否为大肠杆菌引起的，本实验对该猪场采集的棉拭子样品进行了细菌的分离纯化、革兰氏染色镜检、生化试验、PCR鉴定、血清型鉴定以及药物敏感性检验。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
病料采集自海阳某猪场疑似大肠杆菌病的腹泻仔猪的粪便及肛门拭子，共48份。
1.1.2 材料及试剂
普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基（LB肉汤）、革兰氏染色剂、细菌微量生化鉴定管、96孔酶标板、Tris-乙酸电泳缓冲液（50×TAE缓冲液）、Goldview核酸染色剂、双蒸水、4种毒力基因的上、下游引物，采购于深圳华大基因科技有限公司，包括E.coilK88-F841bp、E.coilK88-R 841bp、E.coilK99-F543bp、E.coilK99-R543bp、E.coil987P-F463bp、E.coil987P-R 463bp、E.coilF41-F682bp、E.coilF41-R682bp以及16S rRNA引物一共9种引物，购置于南京诺唯赞生物科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix、购置北京天坛药物生物技术开发公司的药敏纸片。
1.2 方法
1.2.1细菌的分离纯化
1.2.1.1配制培养基
在烧杯中按照试剂说明比例加入试剂充分混合，然后将烧杯放置在电陶炉上加热，待琼脂溶解后，分装到相应的锥形瓶中，不超过最大容积的三分之二。塞上橡胶塞，包裹上牛皮纸，放入高压灭菌锅中，121 ℃高压灭菌30 min，再拿出来冷却，最后在无菌条件下，倒入干燥已灭菌的平板中即可。下层培养基的配制基本相似，将上层培养基配料中的琼脂粉减半即可，加热之后趁热分装到试管中，每支试管中5 ml，塞上橡胶塞之后，7支试管一扎，用牛皮纸和橡皮筋包扎好高压灭菌。营养肉汤中不加琼脂粉，所以也就不需要加热，配料完成后，包扎好，直接高压灭菌即可。
1.2.1.2 细菌的分离
将超净台台面用酒精消毒，并且打开紫外灯杀菌20 min。灭菌完成后，用75%的酒精消毒双手。开始操作，点燃酒精灯，将镊子放在酒精灯上来回灼烧几次杀菌，然后打开样品管，用镊子夹取出棉拭子，涂布在培养皿上，并进行编号，然后放入37 ℃恒温箱中24 h后观察。
1.2.1.3 细菌的纯化
待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用灭菌的接种环挑取疑似大肠杆菌的单菌落进行纯化。用接种环在麦康凯培养基上进行划线，分三区划线，画完线的平板放入37 ℃恒温箱中，等长出单菌落后，再次挑取单菌落在麦康凯培养基进行划线分离纯化。这样重复3次，直到菌落完全纯化，挑取单菌落到5 ml LB肉汤试管中，在37 ℃恒温摇床中过夜培养12 h。
1.2.2 细菌的鉴定
1.2.2.1 革兰氏染色镜检
对纯化好的单菌落进行革兰氏染色。首先将载玻片洗净擦干，在灼烧杀菌，然后在载玻片中央滴一滴生理盐水，用灼烧冷却后的接种环挑取单菌落，在生理盐水中涂匀，用酒精灯烤干固定，然后拿出革兰氏染色剂中的草酸铵结晶紫，滴1滴，染色1 min，1 min后，用蒸馏水冲洗，然后再用碘液染色1 min，1 min后，用蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分，用95%的酒精数滴进行酒精脱色，30 s后，水洗，吸水，最后用沙黄1滴，染色1 min，然后用蒸馏水冲洗，再用吸水纸吸干水分。干燥后镜检，油镜下观察细菌形态。
1.2.2.2 细菌的生化鉴定
用糖发酵试验，选取葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇5种细菌微量生化鉴定管对分离菌株进行生化特征鉴定。在无菌环境下，用灼烧冷却后的接种环挑取适量的、待检验菌苔于生理盐水中，混合均匀，制备细菌悬浊液。用移液器分别取100 μl细菌悬浊液加入5种细菌微量生化鉴定管中，在37 ℃培养18～24 h后，观察颜色变化，并与鉴定标准进行对比[5][6]。
1.2.2.3PCR鉴定
首先是大肠杆菌特异性引物的鉴定。根据深圳华大基因科技有限公司研发的大肠杆菌特异性鉴定引物，EC370-F：5，-GATAAGCCCGCAGTCACCT-3，， EC370 -R:5，-TCCCGTAACTCATCACCATCA-3，，对分离的各细菌菌株进行鉴定。用菌液做DNA模板，配制成25 μl的PCR反应体系。其中需要上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA模板2 μl，双蒸水8.5 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl。将反应体系混合均匀，用瞬时离心机瞬离，按照95 ℃预变性5 min，开始循环。最后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，预期扩增的目的片段大小为370 bp。量取100 ml 1×TAE缓冲液于烧杯中，称取1 g琼脂糖放入其中，用电陶炉加热融化直到液体清亮，将其冷却到40-60 ℃，再用移液器取5μl核酸染色剂，摇晃混合均匀，在凝胶盘中放好凝胶板，事先根据样品数量需要放入梳子，将配好的胶倒入凝胶盘中，使胶板的厚度大约为5 mm，放置30 min，制备成1.0%琼脂糖凝胶。胶板冷却凝固后，拔出梳子，将凝胶连同凝胶板放入水平电泳槽，倒入1×TAE缓冲液淹没胶面。PCR反应完成后，各取5 μl PCR扩增产物加入到各个加样孔中，并且加入阳性对照，同时加入标准分子量Maker做分子质量大小对照，在120 V电压下电泳20 min。在电泳结束后，关掉电源，取出凝胶，放进天能凝胶成像系统中，打开其中的紫外灯，辅助其余的灯光，观察条带。
其次是大肠杆菌血清型的鉴定。根据刘泽文等报道的大肠杆菌K88，K99，987P，F41四种毒力基因，进行大肠杆菌的血清型鉴定。以菌液为模板配制成25 μl的PCR反应体系，进行PCR反应。反应条件按照95 ℃预变性5 min，开始循环：94 ℃变性30 s，设置48℃-48℃ -46℃-45℃的梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，最后72 ℃总延伸10 min，终止反应20 min。扩增完成后，进行电泳，观察条带。
1.2.3 药敏试验
采用药敏纸片法对分离得到的菌株做药物敏感性测定。在无菌条件下，用移液器取100 μl经纯培养的菌液，置于琼脂平板内，用一次性涂布棒将菌液涂均匀布在琼脂培养基表面上，等待平板上的水分完全被吸收之后，贴上药敏纸片。用酒精灯灼烧过的冷却后的无菌镊子夹取出药敏纸片分别平贴在琼脂表面，每个琼脂平板上贴5张不同的药敏纸片，各个纸片的间距不能少于25 mm，每张纸片的中心离平板边缘不少于15 mm。将操作完的平板反扣过来，放置在37 ℃ 恒温温箱中培养18～24 h，然后取出，从平板背面测量抑菌圈的直径[9][10]。
2 结果
2.1 细菌的分离培养和形态学观察
经37 ℃恒温培养24 h后，可以看见在普通琼脂上形成圆形菌落。在麦康凯培养基上形成圆形粉红色菌落，可见表面光滑、扁平、凸起，经过连续传代培养后菌落大小均一样。革兰氏染色镜检发现染色的菌体呈红色，为革兰氏阴性菌，且单一或两个存在，两端钝圆的短杆菌，因此初步判断为疑似大肠杆菌。
2.2 生化鉴定
5种糖发酵试验结果显示，分离到的菌株能够在葡萄糖、乳糖、麦芽糖以及甘露醇发酵管中产酸产气，不能利用蔗糖，根据生化反应结果判定为大肠杆菌。
2.3 PCR鉴定
用PCR方法检测分离菌株的K88、K99、987P、F41四种血清型的鉴定，分离所得到的48株菌株均未扩增出K88、K99、F41的目的条带，其中有2株细菌用987P引物扩增出了目的条带，大小为463bp。
2.4 药敏实验
用药敏纸片扩散法对48株菌株进行耐药试验，并根据《欧盟药敏试验标准》进行判定。根据药物敏感性测定的结果判断菌株对头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星敏感，对青霉素、新霉素、多西环素、氨苄西林、庆大霉素耐药。
3 讨论
本实验从烟台海阳某养猪场采集的仔猪腹泻样品中分离到大肠杆菌菌株，并对其进行了革兰氏染色镜检，生化鉴定，PCR鉴定，以及药物敏感性测定。在实验中遇到了许多问题。猪源致病性大肠杆菌的血清型主要有K88、K99、987P、F41四种类型。本试验在PCR鉴定的过程中，K88和K99两组的阳性对照没有出现条带，怀疑K88和K99标准株的序列发生变化，送到机构检测，发现这两株菌没有黏附素基因。所以只鉴定到2株987P血清型的大肠杆菌，其它菌株的血清型有待鉴定。福建农林大学的余佳分离到了F41型的大肠杆菌，湖北的刘泽文等987P型的大肠杆菌，可见不同地区的致病性大肠杆菌血清型存在差异。
本实验对分离到的48株菌进行了药物敏感性测定，发现分离到的菌株对头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星敏感，对青霉素、新霉素、多西环素、氨苄西林、庆大霉素耐药。对该猪场仔猪腹泻的治疗以及日后的防控提出了针对性的解决方法，并提出在药物选择上交替用药，选用中草药方法上单味中药提取物及中药复方对猪大肠杆菌病有较好的效果。
参考文献
[1]孙晓莉，高建，潘乐欣，等. 猪大肠杆菌性腹泻病的病原分离鉴定及药敏试验[J]. 天津农学院学报，2019，26(02)：57-60.
[2]李佳暖，李得鑫，崔元，等. 仔猪白痢病原菌的分离鉴定与敏感药物筛选[J]. 今日畜牧兽医，2016(09)：53-54.
[3]刘泽文，袁芳艳，刘威，等. 仔猪黄痢大肠杆菌的分离鉴定[J]. 湖北农业科学，2019，58（23）：142-144.
[4]余佳. 猪源大肠杆菌的分离鉴定、毒力基因检测及敏感药物筛选[D]. 福建农林大学，2019.
[5]刘辉．中药组方对猪大肠杆菌病抑菌效果观察[J]. 中国畜禽种业，2017，13( 5)：101．
[6]刘祥祥．猪大肠杆菌病防治技术[J]. 乡村科技，2016( 18)：34．
[7]徐文翠，赵红. 猪大肠杆菌病诊治研究进展[J]. 畜禽业，2019，30(06)：75+77.