郑卓昊1# 李峰1# 徐心悦1# 景秀丽1*
1山东第一医科大学(山东省医学科学院) 生命科学研究中心，山东 泰安 271000
摘要：研究AMPK选择性抑制剂Dorsomorphin可否减轻急性过敏性哮喘症状。采用 50μg papain滴鼻免疫 C57BL/6小鼠诱导急性过敏性哮喘模型，用 AMPK 选择性抑制剂 Dorsomorphin 处理小鼠，每天用抑制剂处理小鼠以达到持续抑制AMPK信号通路。处理之后 6 天，pbs、papain、papain +Dorsomorphin组进行对比，分别比较各组肺和BALF中炎症性细胞：包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的数量变化情况，以及肺组织炎症性细胞浸润和粘液分泌情况。结果：pbs组炎症性细胞数量较少，肺组织几乎没有炎症性细胞浸润及粘液分泌；papain组炎症性细胞数量显著增加，肺组织炎症性细胞浸润严重，粘液分泌较多；而Dorsomorphin+papain与阳性对照papain组相比，炎症性细胞数量显著减少，肺组织炎症性细胞浸润减轻，粘液分泌显著减少。结论：AMPK选择性抑制剂Dorsomorphin可以减轻炎症，减缓急性过敏性哮喘症状
关键词：Dorsomorphin；急性过敏性哮喘；AMPK
哮喘是以气流阻塞、黏液高分泌、嗜酸粒细胞及肥大细胞浸润气道壁为特征的常见慢性呼吸系统疾病[1]，一般是由花粉、霉菌、尘螨及通过空气传播的刺激物或传染病等过敏原引起的。它被世界医学界公认为四大顽症之一，被列为十大死亡原因之最，影响了接近 3％的人口，并且发病率在过去10年里一直持续增长。哮喘是一种异物性疾病，包括过敏性哮喘、非过敏性哮喘及本身固有的一些种类，其中过敏性哮喘最为常见。过敏性哮喘一般被认为是由Th2细胞介导的Th2型免疫反应，主要是通过产生Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13和抗原特异性的IgE和IgG1介导炎症反应。Dorsomorphin 作为AMPK的选择性抑制剂，可否减轻急性过敏性哮喘症状，尚不清楚。本研究通过观察支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺组织炎症性细胞，包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的数量变化情况及肺组织炎症情况，分析Dorsomorphin对急性过敏性哮喘小鼠炎症的影响,为探讨Dorsomorphin治疗哮喘的作用机制打坚定基础。
1.材料和方法
1.1 材料
C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，Dorsomorphin和papain购自Sigma公司。
1.2 动物免疫和处理
将20只C57BL/6小鼠随机分为3组，pbs组、papain组、papain+Dorsomorphin组。papain组和papain+Dorsomorphin组用50μg过敏原 papain连续滴鼻免疫3天（day0、day1、day2），免疫的同时腹腔注射Dorsomorphin(5mg/kg)，诱导正常C57BL/6小鼠急性过敏性哮喘模型。免疫后第5天（day6）处死，分析检测各处理组滴鼻免疫后day6时肺及支气管肺泡灌洗液（BAL）中炎症性细胞，包括嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的数量变化情况。
1.3 方法
1.3.1分析灌洗液中炎症性细胞变化
支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 收集及细胞分类计数。
末次滴鼻免疫24后眼球采血、行支气管肺泡灌洗后取肺组织。通过气管插管行支气管肺泡灌洗，分 2 次缓慢注入 PBS液，分别为0.7 mL和0.7 mL，缓慢收集，回收率约为 80%。BALF , 2500 r/min 离心, 5min，收集上清液 -20 ℃保存待测。细胞沉淀用 0. 2 mL PBS 重悬，并用血细胞计数板进行细胞分类计数。取 100 μL 细胞悬液进行离心甩片，室温晾干后进行 Diff-Quik染色，光学显微镜下进行细胞分类计数，求数200 个细胞，求出各类白细胞百分比，进而计算出各类白细胞的细胞数目。
1.3.2 分析肺组织中炎症性细胞变化
处死小鼠后取肺组织，剪碎后用3mL 0.5% Ⅳ酶消化，于37℃恒温培养箱消化1h，MACS终止消化，在细胞滤网上研磨，MACS定容，离心，去上清，加入5mL 40%Percoll液与细胞混匀，离心，2mL ACK裂红5min，离心，去上清，过细胞滤网，离心，弃上清，用MACS混匀制备得到肺单细胞。细胞沉淀用 0. 2 mL PBS 重悬，并用血细胞计数板进行细胞分类计数。取 100 μL 细胞悬液进行离心甩片，室温晾干后进行 Diff-Quik染色 ，光学显微镜下进行细胞分类计数，求数200 个细胞，求出各类白细胞百分比，进而计算出各类白细胞的细胞数目。
1.3.3 肺组织病理切片
将4%多聚甲醛固定24h的左肺组织梯度酒精脱水、石蜡包埋切片、HE和PAS染色，光镜下观察肺组织形态结构、气道肺泡损伤、炎症细胞浸润、粘液的分泌等病理改变。
1.3.4 统计分析
每组 3 只或 3 只以上小鼠，实验独立重复 3 次以上。使用GraphPad Prism6.0 软件。使用独立样本t检验分析数据， *表示 P<0.05，**表示 P<0.01，***表示 P<0.005，****表示 P<0.0001。
2.结果
2.1 Dorsomorphin对BALF中炎症性细胞的影响。
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图1. 各组小鼠 BALF 中细胞总数、白细胞分类计数的比较
Dorsomorphin干预组（papain+dorsomorphin组）小鼠BALF有核细胞总数、嗜酸性粒细胞数目、中性粒细胞数目、淋巴细胞数目与阳性对照哮喘组（papain组）相比都显著性下降，差异均有统计学意义 （均Ｐ＜0.01＝；但与正常对照组（pbs组）相比，嗜酸性粒细胞数目、中性粒细胞数目和淋巴细胞数目略有上升趋势，但均无统计学显著性，见图 1。
2.2 Dorsomorphin对肺组织中炎症性细胞的影响。
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对肺组织中炎症性细胞进一步观察，发现与BALF中相类似的结果，Dorsomorphin干预组（papain+dorsomorphin组）小鼠肺组织中有核细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞细胞数目、淋巴细胞数目与阳性对照哮喘组（papain组）相比也都显著性下降，差异均有统计学意义 （均Ｐ＜0.05），但与正常对照组（pbs组）相比，无明显差异，见图 2。
2.3 Dorsomorphin对肺组织炎症性细胞浸润和粘液分泌的影响。
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阳性对照哮喘组（papain组）均可以看见小鼠支气管和血管周围可见大量炎症细胞浸润，气道壁及气道平滑肌稍增厚，气道壁可见上皮细胞脱落，杯状细胞增多，粘液分泌增加；Dorsomorphin干预组上述炎症显著性减弱，小鼠支气管周围炎症细胞浸润和粘液分泌较阳性对照组显著性减少。正常对照组（pbs组）小鼠支气管无明显炎症细胞浸润，气道上皮细胞排列整齐，见图3。
综上所述，AMPK选择性抑制剂Dorsomorphin能同时使肺和BALF中炎症性细胞数量都显著性下降，肺组织中炎症性细胞浸润和粘液的分泌也显著性减少。因此，上述结果提示AMPK选择性抑制剂Dorsomorphin可以减缓急性过敏性哮喘症状。
3.讨论：
过敏性哮喘是一种以气管变态性炎症 (AAI) 和气管高反应性 (BHR) 为特征的疾病。目前，研究除了明确过敏性哮喘属于Th2型免疫反应外，对过敏性哮喘的病因及其确切发病机制仍不清楚，并且还没有有效的方法进行防治。AMPK是一种广泛表达且高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，作为能量代谢调节器，参与了能量物质的氧化分解。最近多项研究表明二甲双胍作为AMPK的激活剂可以减少炎症因子，减轻哮喘的病理反应，改善哮喘患者的预后[2-7]。Dorsomorphin作为AMPK的抑制剂，可以视为二甲双胍的拮抗剂。Dorsomorphin可影响骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP），参与骨组织生长调控。在此本研究中，Dorsomorphin能显著的降低哮喘模型中的嗜酸性粒细胞数量，肺组织中炎症性细胞的浸润及粘液的分泌，与其拮抗剂对于炎症的调控相同的作用效果相似。这种结果提示出Dorsomorphin可能是通过非AMPK的途径来调控炎症细胞水平。其作用途径可能是Dorsomorphin抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路后, 能够促进细胞自噬,从而降低炎症性细胞的水平[8]。
参考文献
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[7] 马文娴, 郭海琴, 韩新鹏.二甲双胍抑制慢性哮喘小鼠气道炎症、 重塑及新生血管形成.中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology,2017, 33( 4) : 590-595.
[8]Wang S , Xia P , Huang G , et al. FoxO1-mediated autophagy is required for NK cell development and innate immunity[J]. Nature Communications, 2016, 7:11023.
基金项目:国家级大学生创新创业训练计划(201810439028)。
作者简介: 郑卓昊，2015级口腔医学本科学生。
#并列第一作者。
*通讯作者:景秀丽，女，副教授，主要从事呼吸道黏膜免疫相关研究。