罗裕春 庞嘉宁 戴宏智 黎伟寿 梁春
遂溪县人民医院 广东湛江 524300
摘要：目的：研究FoxO3蛋白在膀胱癌中的表达及其与患者临床病理特征和预后关系。方法：选取2019年8月至2021年2月我院收治的40例膀胱癌患者作为研究对象。分为膀胱癌组织组和癌旁正常组织组。使用Western Blot和免疫组织化学染色法检测两组FoxO3蛋白相对含量及表达情况。分析FoxO3蛋白表达与患者临床病理特征及患者预后的相关性。结果：1）FoxO3在正常癌旁组织中阳性表达率（87.5%）高于膀胱癌组织中阳性表达率（20.0%），两组差异具有统计学意义（P＜0.05），膀胱癌组织中FoxO3的表达量低于癌旁正常组织，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）；2）膀胱癌患者淋巴结转移组、组织学分型高级组及癌症分期T2-T3组患者的FoxO3阳性表达率均低于对应的淋巴结无转移组、低级组和Tis-T1期，组间差异具有统计学意义（P＜0.05）；3）FoxO3低表达组膀胱癌患者总生存期（HR=1.4，P=0.029）和无疾病进展生存期（HR=1.5，P=0.015）显著高于高表达组，同时FoxO3阴性表达、组织学分型、癌症分期及淋巴结转移与患者预后具有明显相关性（P＜0.05）。结论：FoxO3蛋白在膀胱癌组织中呈低表达，FoxO3低表达与患者预后具有明显相关性（P＜0.05），是影响预后的危险因素。
关键词：FoxO3蛋白；膀胱癌；临床病理特征；预后；相关性
膀胱癌是人体泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，且在我国的发病率逐年升高[1]。目前常用的膀胱癌治疗方法以手术切除和化疗为主，但是部分患者术后易复发，且复发后造成疾病进展，导致治疗失败和患者死亡[2]。目前膀胱癌确切发病机制尚不清楚，有学者提出，膀胱癌的发生及进展可能与染色体异常、遗传多态性有关，同时组织学分型、癌症分期及淋巴结转移与患者预后有相关性，因此在分子机制上探讨膀胱癌发生机制、复发转移和预后分子标志物成为关注热点[3-5]。FoxO3是叉头盒O类（FoxO）转录因家族重要成员之一，参与多种细胞过程，如细胞周期调控、细胞凋亡等，多篇文献报道，FoxO3 在多种肿瘤包括前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌等肿瘤组织中呈现低表达，且与患者的预后存在一定的关系[4-7]。本研究以40例膀胱癌患者作为研究对象，探讨FoxO3蛋白表达与患者临床病理特征及患者预后的关系。
1.资料与方法
1.1一般资料
选取2019年8月至2021年2月我院收治的40例膀胱癌患者作为研究对象。其中男25例，女15例。年龄在32~65周岁，平均年龄41.5±5.8周岁。按照现行癌症分期标准，其中Tis-T1期浅表性膀胱癌患者24例，T2-T3期非浅表性膀胱癌患者16例，组织学分型低级30例，高级10例。局部发生淋巴结转移者10例，未发生局部淋巴结转移者30例。另外选取经过病理确认后膀胱癌旁正常组织40例作为对照。
纳入标准[5]：1）符合膀胱癌诊断标准，且经过病理学确诊属于膀胱移行上皮肿瘤；2）术前未经过辅助治疗；3）患者意识清醒且具有主观行动能力；4）患者病历资料完整且对本研究知情同意，签署知情同意书。
排除标准[1]：1）合并患有其他膀胱肿瘤或发生良性病变；2）术前已经用过药物治疗或者放化疗；3）已经发生肿瘤远处转移患者；4）合并患有其他恶性肿瘤或者慢性传染病患者；5）不配合医生指示或者要求的患者。
该研究已经通过本院伦理委员会批准，患者的性别、年龄、病程等资料的差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2方法
将膀胱癌患者在术中留取的原发位置的肿瘤组织及癌旁正常组织（距癌组织＞3cm）作为样本，使用PBS缓冲液冲洗后，立即置于液氮中冷冻，而后转移至-80℃冰箱中保存，用于组织蛋白的提取。
从－80°C 冰箱取出配对组织标本，在研钵中用液氮研碎，加入含有各类蛋白酶抑制剂的RIPA 解液和裂解液（购自南京碧云天生物技术有限公司），冰上操作，孵育30min后，使用台式微型离心机离心13000rpm，30min（购自Bechman Coulter公司，型号：Mierofuge18），而后将上清液转移到1.5mL EP 管中。经蛋白定量后取适量蛋白，加入缓冲液并在100°C条件下煮沸10 min。25mA恒流条件下进行 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后在100V恒压条件下进行湿转1h，将蛋白转移至 NC 膜上，并用5%脱脂奶粉封闭（4℃，1h），用PBST缓冲液洗涤4次，而后加入-actin和occludin抗体（购自Santa Cruz 公司）4°C孵育过夜，之后用PBST缓冲液洗膜5次，加入HRP标记的二抗（购自中杉金桥公司），室温孵育1h，而后用PBST洗膜3次之后使用ECL化学发光检测试剂盒（购自Thermo公司）进行显色，而后使用凝胶电泳自动成像，测定FoxO3蛋白相对含量。
使用免疫组织化学染色法检测FoxO3蛋白的表达情况，阳性对照：正常膀胱组织；阴性对照：PBS缓冲液代替一抗。经过分别分别滴加一抗和二抗之后，并显色、封皮处理后，显微镜下观察阳性细胞数，阳性染色细胞＞10%为阳性表达，≤10为阴性表达。
1.3 观察指标
对所有患者进行随访，分析FoxO3蛋白表达与患者临床病理特征及患者预后的相关性。
1.4统计学分析
采用STATA12.0分析本研究数据，计量资料以表示，组间两两比较采用t检验，计数资料采用%表示，采用2检验比较，P＜0.05视为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 FoxO3蛋白的表达情况
FoxO3在正常癌旁组织中阳性表达率为87.5%，而在膀胱癌组织中阳性表达率为20.0%，两组差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表1。另外根据Western Blot的结果显示，膀胱癌组织中FoxO3的表达量低于癌旁正常组织，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。
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2.2 膀胱癌患者临床特征与FoxO3蛋白表达情况的相关性
膀胱癌患者淋巴结转移组、组织学分型高级组及癌症分期T2-T3组患者的FoxO3阳性表达率均较低，与无转移组、低级组和Tis-T1期的组间比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表2。同时对比了性别年龄等FoxO3蛋白表达情况差异并无统计学意义（P＞0.05）。
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2.3 FoxO3蛋白表达与预后相关性比较
前期研究中，根据FoxO3蛋白表达水平中位数，将膀胱癌患者分为高低表达组，使用Log-rank检验，显示FoxO3低表达组膀胱癌患者总生存期（HR=1.4，P=0.029）和无疾病进展生存期（HR=1.5，P=0.015）显著高于高表达组，详见图1。
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3.讨论
研究显示FoxO3过表达对抑制细胞生长和分化具有重要作用[8]，随着肿瘤恶化和转移，细胞中P13K PKB／c-Akt 信号通路被激活，通过抑制FoxO3的表达，促进细胞的分化和存活。此外活化的FoxO3蛋白会促进细胞凋亡，阻止肿瘤进展，使预后良好，因此FoxO3有望成为临床诊断和生物治疗的新靶点[9-10]。田跃军等[6]研究发现FoxO3a在泌尿系肿瘤中存在异常的低表达，同时亚细胞定位和相关信号通路的也出现异常，有望成为泌尿系肿瘤诊断和预后的新型分子标志物。
本研究发现，与癌旁正常组织相比，FoxO3在膀胱癌组织中的表达量明显降低，两组差异具有统计学意义（P＜0.05），同时FoxO3低表达组膀胱癌患者总生存期（HR=1.4，P=0.029）和无疾病进展生存期（HR=1.5，P=0.015）显著高于高表达组，其原因可能是FoxO3 受到是 P13K PKB／c-Akt 信号通路调节，该信号通路磷酸化可导致FoxO失活，从而导致FoxO3表达水平降低。此外有研究指出，FoxO蛋白家族成员可以作为肿瘤抑制剂，其细胞缺失会造成进行性癌症倾向，侧面证明本次研究结果的可靠性。同时本次研究中发现FoxO3阴性表达与患者预后具有明显相关性（P＜0.05），且膀胱癌患淋巴结转移组、组织学分型高级组及癌症分期T2-T3组患者的FoxO3阳性表达率均低于对应的淋巴结无转移组、低级组和Tis-T1期，组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。杨晗杰等[5]研究发现FoxO3蛋白在膀胱癌组织中呈显著低表达，同时是患者预后不良的危险因素。与本研究结果基本一致。
综上所述，FoxO3蛋白的低表达可能与膀胱癌的临床病理特征和预后有相关性，因此FoxO3蛋白的表达情况可以作为患者预后的标志物之一，由于本次研究样本量有限，具体FoxO3蛋白的肿瘤表达机制及预后标志情况还需要进一步研究。
参考文献：
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基金项目：湛江市科技计划项目（2019B01221）