全宇
甘孜藏族自治州疾病预防控制中心 四川甘孜 626000
摘要：目的：建立环介导等温扩增法（LAMP）对肠道门诊感染性腹泻患者的志贺菌进行检测。方法：抽取2019年8月至2020年10月疾控中心接收的腹泻患者（670例）作为研究对象，检测其粪便标本，将其随机分为三组，即A组、B组、C组，分别予以荧光定量PCR、分离培养及LAMP检测方法，并落实对该方法的特异度及灵敏度试验，将C组试验结果与A、B两组进行对比。结果：通过分析比较发现，三组方法的检测结果差异较小，无统计学意义（P＞0.05）；LAMP检测方法具备较高的敏感度及特异度。结论：LAMP法主要是指应用水浴锅实现等温扩增，可基于见光，抑或是紫外灯下肉眼观察结果，优势主要体现于简单、快速等方面，可作为疾控医疗机构志贺菌检测的首选方法。
关键词：环介导技术；细菌性痢疾检测；应用
Abstract: Objective: To establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the detection of Shigella in intestinal outpatient patients with infectious diarrhea. Methods: from August 2019 to October 2020 CDC received diarrhea patients (670 cases) as the research object, the stool specimens, which were randomly divided into three groups, namely, group A and group B, group C, respectively be fluorescent quantitative PCR, cultivation and LAMP detection method, and the specific implementation of this method and sensitivity test, the test results of group C compared with A, B two groups. Results: Through analysis and comparison, it was found that there was little difference in the detection results of the three groups (P > 0.05). LAMP detection method has high sensitivity and specificity. Conclusion: LAMP method mainly refers to the use of water bath to achieve isothermal amplification, which can be based on the results of visible light or naked eye observation under UV LAMP. Its advantages are mainly reflected in simplicity, rapidity and other aspects, and it can be used as the preferred method for Shigella detection in disease control medical institutions.
Key words: loop-mediated technology; Bacterial dysentery detection; application
环介导等温扩增技术（LAMP）是一张新型核算扩增方法，可对靶DNA上6个特定区域、4条引物及具有链置换活性DNA聚合酶进行识别，处于恒温条件下时，反应时间在1至2小时左右，就可实现基因扩增。本文主要是在基于LAMP技术原理的前提下，结合以志贺菌侵袭性质粒抗原H基因中的保守区，设计了4条特异性引物，检测标准菌株痢疾志贺菌，优化反应体系后，在实际样品中进行检测，将其予以荧光PCR法予以对比处理。
1、资料与方法
（1）一般资料
抽取2019年8月至2020年10月疾控中心接收的腹泻患者（670例）作为研究对象，检测其粪便标本，菌株包含福氏志贺菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、链球菌等，由我省疾病预防控制中心提供。使用的仪器包含了荧光定量PCR仪、电热恒温水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统及离心机。试剂包含了志贺氏菌增菌肉汤、API20E生化鉴定试剂、志贺氏菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，试剂使用均为超过有效期。
（2）方法
DNA模板制备：在基于志贺氏菌核酸检测试剂盒相关要求的前提下，取便标本，大小以黄豆粒为参照，将其与0.5ml生理盐水进行稀释处理，取标准菌株的增菌液，剂量为1ml，置于离心管中，予以振荡处理，离心2分钟，将上清弃掉，将DNA提取液加入到沉淀中，进行混匀，沸水浴10分钟，之后离心5分钟，获取的上清液，就可作为模板。
LAMP引物设计：在基于志贺菌ipaH基因序列中保守区的前提下，使用Primer
5．0实现对外引物及内引物的设计，前者分别为F3和B3，后者分别FIP和BIP，如表1所示。
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优化LAMP反应体系：构建初始反应体系，对镁离子、内外鹦鹉、反应温度及时间等进行调整后，对所提取的标准模板予以LAMP检测，实现对LAMP反应体系的明确，用肉眼观察有无白色沉淀物，抑或是添加相应的荧光染料，基于紫外投射仪的前提下，对绿色荧光反射进行观察。另外，也可应用可取51xL的产物落实1．5％的琼脂糖凝胶电泳，对LAMP有无发生情况进行明确，最终达到对LAMP扩张引物有效性判断的目的。
2、结果
（1）实际样品检测
将分离培养法作为金标准，检出结果提示志贺菌阳性的有90份，荧光定量PCR法和LAMP法结果提示志贺菌阳性的均为105份，将上述检测方法的结果进行对比发信啊，符合率为100%，检出率间呈现的差异不具统计学意义（P＞0.05）。具体见表2。
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（2）LAMP法特异度
应用建立的志贺菌LAMP检测方法实现对大肠杆菌、福氏志贺菌、链球菌、痢疾志贺菌等菌株检测，志贺菌以梯状条为特征，最小DNA片段在150bp处，结果提示呈阳性，其余未见条带，扩增结果均提示呈阴性。由此可说明，LAMP法的特异度较高。
（3）LAMP法灵敏度
痢疾杆菌标准菌接种到志贺氏菌增菌肉汤，在基于平板计数法的前提下，获取原始菌液浓度（4.7x108），按照10倍倍比的稀释原始菌液，合理的取各稀释度菌液，剂量均为1ml，提取DNA模板，应用LAMP及荧光PCR进行检测。在检测后，LAMP结果提示在菌液浓度为4.7×1O1CFU／mL至4.7x108CFU／mL范围时，可观察到管底有白色沉淀，而菌液浓度未超过4.7×1O1CFU／mL时，未见沉淀现象。同时，将SYBRGreenI染料到LAMP反应体系中，经反应后，在基于紫外灯的前提下对颜色变化进行观察，如若荧光为绿色，则提示阳性，荧光为橙色则提示为阴性，有利于更加方便的观察结果。通过对荧光PCR结果的分析发现，当菌液浓度处于4.7X102CFU／mL至4.7X108CFU／mL范围时，可观察到S扩增曲线，反之未超过4．7x102CFU／mL时，则可观察到阴性反应。通过比较发现，相较于荧光PCR法，LAMP法的敏感性更高。
3、讨论
志贺菌是肠杆菌科最为常见的一种致病菌，具有传染性较强、危害性较大等特点，是引发细菌性痢疾的关键因素。据有关报道指出，全世界每年细菌性疾病的发病人数超过1亿人次，尤其是是发展中国家，占据比例较大，在98%左右，死亡率较高，其中有约为60%的为5岁以下儿童[1]。在患上细菌性痢疾后，患者的主要表现为结肠黏膜充血、水肿等炎症渗出性病变，治疗以抗炎、调节菌群紊乱、止泻等综合方案为主。受抗菌药物的广泛应用，志贺菌往往会对某些抗菌药物产生耐药性，需引起重视。而志贺菌又分别为四种菌型，即福氏、宋内、痢疾及鲍氏志贺菌，在志贺菌检验的过程中，往往应用的是国标法（GB／T4789．5-2013）、PCR方法等，前者需要耗费较长的时间，且敏感性不够理想，后者虽然具有较高的灵敏度及快速检测等优势，但检测成本相对较高，所用仪器非常昂贵，对于基层单位来说，适用性不强。因此，建立一套新的检测方法就显得尤为重要，确保方法具备快速、准确及操作简单等优势，有利于为疾病诊断、控制，抑或是流行病学调查的顺利进行奠定基础。
另外，在肠道常规检测中，志贺菌检测属重要项目之一，本次研究中建立的LAMP方法，其目的是为志贺菌提供更好的检测，从对DNA的提取直至实验室结束，所耗费的时间约为1.5小时，且还具备操作简单、成本低廉等优势，在一定程度上缩短了检测时间，促进了检测效率的提高。LAMP技术可在基于等温条件的前提下，达到基因快速扩增的目的，优势体现在扩增反应快、灵敏度及特异度高等方面，扩增产生的产物量较大，可形成白色的焦磷酸镁盐沉淀，故就可直接在肉眼的前提下，对结果进行合理的判别[2]。
现阶段，国标中对于志贺菌的检测，传统方法为分离培养，也属于金标准，但此方法需要耗费较长的时间，从报告阳性病例到获取志贺氏菌株需要的时间最少不低于5天，检测过程中，极有可能受到人为主观因素的干扰，加之血清分型鉴定试剂保质期短、效价低等缺陷因素的影响，极有可能发生假阴性，从而导致漏检情况的发生。另外，对PCR法进行详细分析发现，需要应用特殊的仪器，且对试验环境以及试剂提出了较高的要求，会增加检测结构的经济负担。LAMP法不需要依赖仪器，操作起来非常简单、方便，且敏感性也较高，对于基层实验室来说，此方法尤为适用。但值得注意的是，LAMP法检测为志贺菌通用核算，当检测结果提示呈阳性时，仅仅只能说明标本中含有某种志贺菌，无法进行直接分离，不能展开同源性分析[3]。考虑到上述情况，建议可将LAMP方与传统分离培养进行结合应用，在筛查标本的过程中，可先应用LAMP实现，之后检测阳性标本时，就可应用分离培养法，从而可进一步促进检出率的提高。从上述内容就可发现，在菌株检测中，LAMP方法主要发挥着补充分离培养方法的作用，不能完全的代替分离培养方法，此技术不需要应用特殊仪器设备，普通实验室条件就可完成。
通过本研究可发现，通过分析比较发现，三组方法的检测结果差异较小，无统计学意义（P＞0.05）；LAMP检测方法具备较高的敏感度及特异度。说明，LAMP法主要是指应用水浴锅实现等温扩增，可基于见光，抑或是紫外灯下肉眼观察结果，优势主要体现于简单、快速等方面，可作为疾控医疗机构志贺菌检测的首选方法，应用前景良好，值得加大对这方面的研究力度。
参考文献
[1]温来欣，方丽萍．应用LAMP同时快速检测沙门菌和志贺茵的效果评价[J]．职业与健康，2018，30(4)：654—655．
[2]焦文强，殷相平，柳纪省．环介导等温扩增技术原理及其在检测诊断病原微生物中的应用[J]．生物技术通报，2019，18(9)：54—57．
[3]吴静怡，董路宁，任立松，等．痢疾杆菌快速检测方法的研究进展[J]．中国卫生检验杂志，2018，20(4)：257—259．