符成修
海南合瑞制药股份有限公司 海南省海口市 570311
【摘要】目的 围绕注射用头孢西丁钠，建立与之相匹配的无菌检查方法，并开展适用性试验。方法 依据《中国药典（2015年）》无菌检查法当中的薄膜过滤法来开展试验，通过优化相关条件（如冲洗量等），构建注射用头孢西丁钠的无菌检查方法。结果 将无菌氯化钠
-蛋白胨缓冲液（pH7.0）当作冲洗液，冲洗量为800mL/管，将2mLβ-内酰胺酶加入到各管培养基中，能将头孢西丁钠的抑菌作用消除掉。结论 此方法对注射用头孢西丁钠的无菌检查有效且可行。
【关键词】无菌检查；适用性试验；注射用头孢西丁钠
头孢西丁钠实为一种新型的头霉素类抗生素，通常由甲氧头孢菌素C（链霉素产生）通过伴合成处理而最终制得。此药对革兰阴性菌有良好的抑制作用，抗β-内酰胺酶强劲。在当前临床当中，多用作呼吸道感染、心内膜炎（敏感菌所引起）及软组织感染、关节感染等的治疗。依据《中国药典（2015年）》中的相关要求，无论是何种处于市场销售状态的注射制剂，都需要开展无菌检查，且合格后方能销售。在无菌检查过程中，需要实施与之相匹配的适用性试验，以明确所用方法适用于此产品的无菌检查。本文围绕注射用头孢西丁钠，就其无菌检查方法开展针对性的适用性试验，现探讨如下。
1.基础材料
（1）仪器。浙江泰林生物技术股份有限公司生产的智能集菌仪（HTY-601型）；上海沪西医疗仪器厂生产的旋涡混合仪（ZH-2型）；浙江泰林生物技术股份有限公司产的全封闭集菌培养器（NKF330型）；德国宾得公司产的生化培养箱（KB400型）。（2）样品与试剂。扬子江药业集团有限公司生产的注射用头孢西丁钠；自制无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH7.0）、无菌氯化钠溶液（0.9%）；中国食品药品检定研究院提供的β-内酰胺酶。（3）试验用菌种。铜绿假单胞菌CMCC（B）10104、白色念珠菌CMCC（F）98001、大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、黑曲霉菌CMCC（F）98003、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501，都购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。（4）培养基。硫乙醇酸盐流体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基；均购自北京奥博星公司。
2.方法与结果
2.1制备菌液
把接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的新鲜培养物置入到胰酪大豆胨液体培养基当中，培养18~24h（30~35℃）；而对于已接种生孢梭菌的培养物，需要置入到硫乙醇酸盐流体培养基当中，培养18~24h（温度同上）；将接种白色念珠菌的培养物置入到沙氏葡萄糖液体培养基当中，培养24~48h（20~25℃）。[1]针对此些培养物而言，采用无菌氯化钠溶液（0.9%）进行稀释，使之成为每1mL含有均数＜100cfu的菌悬液；针对接种有黑曲霉的培养物，将其置入到沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基当中，培养5~7d（20~25℃），产生大量孢子，然后将0.9%无菌氯化钠溶液（含有0.05%聚山梨酯80）3~5mL，洗脱孢子，将孢子悬液吸出到灭菌试管中，采用0.9%无菌氯化钠溶液稀释菌液，使之成为每1mL＜100cfu的菌悬液，然后将其备用[2]。
2.2检查培养基灵敏度
取7支硫乙醇酸盐流体培养基（12mL/管），分别接种生孢梭菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌（均＜100cfu），分别为2支，另外1支不进行接种，作为空白对照；取7支胰酪大豆胨液体培养基（9mL/管），分别接种黑曲霉、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌，均为2支，另外1支不进行接种而作为空白对照，培养时间为5d。
2.3检查培养基的无菌性
取2种培养基，均为5瓶，置于规定温度下，进行培养14d，都无菌生长。判此批胰酪大豆胨液体培养基及硫乙醇酸盐流体培养基的无菌性检查与相关规定相符。
2.4验证方法（薄膜过滤法）
2.4.1操作方法
采用50mL浓度为0.9%的无菌氯化钠溶液润湿集菌培养器的滤膜，将其效率提升至最大。用无菌氯化钠溶液（0.9%）对30瓶样品进行溶解后，抽入集菌培养器所对应的3支滤筒内，进行过滤操作。各张滤膜过滤量都是10瓶。[3]各只培养器对应的滤筒，均用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（简称为“缓冲液”）进行冲洗，每次100mL，一边冲洗一边振摇。在最后一次冲洗液当中，将试验菌（每1mL＜100cfu），把硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基均加入到集菌培养器所对应的滤筒内，各滤筒内都需要将一些β-内酰胺酶加入，恒温培养，培养时间≤5d[4]。
2.4.2预试验组
将白色念珠菌、金黄色葡萄球菌当作预试验组的敏感菌株，取供试品30瓶，依据上述步骤来操作。各集菌培养器所对应的滤筒用700mL缓冲液进行冲洗，且将β-内酰胺酶（1mL）加入来操作，在规定时间内，集菌培养器（含白色念珠菌）不生长；如果用β-内酰胺酶（1mL）+缓冲液（1000mL）的方法，或者是β-内酰胺酶（2mL）+缓冲液（800mL）来操作，此时，集菌培养器（含有白色念珠菌或者金黄色葡萄球菌）都生长良好；所以，这两种冲洗条件均可行，但需要指出的是，如果有过大的冲洗量，那么会损坏滤膜，影响结果判断，所以选择β-内酰胺酶（2mL）+缓冲液（800mL）。
2.5无菌检查样品
取30瓶注射用头孢西丁钠，依据上述方法来操作，各管冲洗液用量均为800mL，最后将大肠埃希菌（1mL＜100cfu）加入到集菌培养器（含硫乙醇酸盐流体培养基）中，均培养14d，每日进行观察，结果与规定相符。
3.小结
综上，通过上述操作得知，各管冲β-内酰胺酶（2mL）+缓冲液（800mL）以及β-内酰胺酶（1mL）+缓冲液（1000mL）的方法，均能将头孢西丁钠所具有的抑菌作用给消除，不影响试验结果。但由于无菌检查中有着越大的冲洗量，其对滤膜所造成的损害也就越大，因此，最终选择β-内酰胺酶（2mL）+缓冲液（800mL）来对注射用头孢西丁钠进行无菌检查操作。
参考文献：
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[3]卫延明, 陈子龙, 闵朕,等. 三种西药制剂微生物限度检查方法适用性试验的研究[J]. 海峡药学, 2020, 240(01):63-66.
[4]李萌, 欧阳丽影. 甲硝唑氯己定洗剂微生物限度检查法方法适用性试验[J]. 黑龙江医药, 2019, 032(006):1287-1289.