袁松
南充市南部县人民医院 四川 南充 637300
与传统的细菌培养等检测手段相比，分子诊断技术具有特异、敏感、快速及便捷等优势，必将在病原学诊断方面发挥越来越重要的作用。尽管目前这些技术尚存在假阳性、假阴性等不足，且操作复杂，成本昂贵，甚至有些技术仍处于起步和基础研究阶段，临床尚有待推广。但随着经济水平的提高和科技的不断发展，分子生物学技术在临床中的转化应用将逐渐成为临床病原学诊断的主要手段。
一、分子诊断的PCR技术
传统的检测方法是基于培养方法对传染病病原体进行表型特性分析。事实证明，分子诊断比传统的方法更快速、更灵敏。在许多情况下，病原体不再需要数天或数周才能复制或繁殖，而相反，传染病病原体鉴别可以在几分钟至数小时即可完成。针对于生物个体的遗传特征分析技术已成为可能。
在过去二十多年中，分子诊断历经彻底革新。随着20世纪80年代聚合酶链反应（PCR）的发明，由于核酸体外复制变成可能，因此仅需患者的少量样品即可获得足够的遗传物质进行疾病检查。 PCR技术需要加热和冷却多个循环步骤。最初，实验室人员需要手动将样品在热水浴和冷水浴之间转移，历时数小时，现在已经实现热循环自动化设备。此外，Taq聚合酶的发现使PCR过程实现自动化及大规模使用。
分子诊断的第一步是从患者标本中提取核酸。现在我们可以使用相对简单和低成本的方法实现核酸提取。但是，这个步骤确实需要耗费时间，并且需要手工操作来装载和拆卸仪器部件。新的核酸提取方法是采用自动化提取，不需要额外的设备或手动步骤。提取过程主要两个阶段是生物体裂解和核酸纯化。裂解阶段可以通过压力，热量，化学物质，超声处理或机械方法；纯化阶段可以通过将核酸固定在结合材料上，经洗涤数次后，再将核酸洗脱到水或缓冲液中。
PCR扩增结束后需要提供一种方法来检查是否获得PCR产物或称为扩增子，如果获得，那么有多少扩增子。过去几年来，凝胶电泳分析是检测PCR产物的主要方法，但非常费力耗时且具有潜在危险。实时荧光PCR技术在扩增过程中实现定量检测扩增子，例如使用荧光染料，DNA浓度及荧光强度均可以实时检测。熔解曲线分析技术根据双链DNA解链温度实现对靶DNA的特异性和准确性检测。
分子诊断PCR方法需要三个不同区域的实验室：PCR前（提取纯化），PCR中（核酸扩增）和PCR后（凝胶电泳分析和熔解曲线分析）。这些实验室需要严格区分，为了最大限度地降低核酸扩增污染的风险——扩增子可能会污染试剂或样本。新技术提供完全“封闭”反应体系，所有的核酸检测定量在密闭容器内进行，这大大降低了污染可能性。
虽然快速鉴别病原 体对患者非常有益，但仅仅了解导致疾病的病原体有时是不够的，因为疾病治疗往往取决于抗菌药物对特定的菌株是否产生耐药反应。幸运的是，许多分子检测技术可以检测到各种抗菌药物的抗性基因。
虽然PCR技术是最常用的技术，但其他序列特异性核酸扩增方法也广泛使用。一些替代方法被称为序列特异性等温扩增技术，因为核酸扩增不需要改变反应温度。各种等温扩增技术共同的优点是非常快速且不需要热循环仪器。转录介导扩增（TMA）和切刻内切酶扩增（NEAR）是等温扩增方法的两个典型技术。
随着PCR技术不断进步，分子诊断方法更小型且更简单。“样品到结果”描述分子诊断过程需要的核酸提取、扩增和分析的整体自动化解决方案。通常，所有试剂包括控件直接存储在各个反应腔体中，反应腔体完全封闭，降低污染风险。这些整体自动化解决方案广泛应用于胃肠道系统，泌尿生殖系统，中枢神经系统，呼吸系统等的传染病的病原体检测。
二、常见方法
1、核酸检测
分子生物技术最早用于病原学诊断是从核酸检测开始。核酸检测技术发展至今，大致经历了核酸杂交、分离、扩增及基因芯片、PCR、DNA图谱分析及DNA测序等技术。
2、蛋白质检测
对于生物体而言，核酸和蛋白质是决定其生物学特性的重要物质，核酸是生物的遗传物质，而蛋白质则是生命活动的体现者。因此，对病原体的检测，除了针对核酸以外，还要研究其蛋白功能。随着人类基因组计划的完成，基因组学的研究重点也转移到了蛋白功能的研究，而后基因时代应运而生的蛋白质组学，也为呼吸道病原体的研究提供了一个新的平台。针对病原体蛋白质组学的检测技术主要是二维电泳和质谱或色谱分析，即将病原体的蛋白通过二维电泳转移到胶上，再经图像分析，选取特定的蛋白质斑点，经酶解和后续的质谱或色谱分析以及数据处理，确定病原体的属性，目前该技术主要用于细菌鉴定和耐药机制方面的研究。国外学者曾报道用蛋白质组学质谱技术检测了MRSA和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌( MSSA)的蛋白质组学，并分析比较了两者的差异，从而证实了蛋白质组学在病原诊断方面的作用。另外，Schaar等利用二维电泳和质谱分析方法发现，卡他莫拉菌的外膜囊泡具有很高的生物学活性，是运输细菌致病因子的关键结构；Soualhine等发现，肺炎链球菌突变株的磷酸盐转运蛋白与细菌耐药有关。
3、生物芯片技术
近年来，生物芯片技术得到了迅猛发展，为病原体的检测提供了新的技术平台。目前用于病原体检测的生物芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片以及微流控芯片实验室等，这些技术凭借其微型化、高通量及自动化等优势，在微生物病原体检测、种类鉴定、功能分析诊断、基因分型、突变筛查以及基因组监测等方面正在发挥着越来越重要的作用。
基因芯片是最早用于病原体的分子生物学芯片。将代表各种病原体的特殊基因信息印制在一张基因芯片上，再经反转录过程与样品结合，即可检测出样本中有无特异病原体基因及其表达水平，由此判断感染的病原体、感染进程以及宿主反应等。