韩燕 孙法威通讯作者
平原县第一人民医院 山东德州 253100
【摘要】目的：研究白芍总苷对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤Bcl-2家族蛋白表达的影响。方法：选择清洁级健康成年雄性SD大鼠60只，随机分成三组：对照组、缺血再灌注组、白芍总苷组，每组大鼠20只；建立大鼠骨骼肌缺血再灌注模型，除白芍总苷组大鼠于灌注前半小时灌胃给药白芍总苷240mg/kg之外，其余两组皆于相同时间经腹腔注射等容量生理盐水；灌注后24h处死大鼠，取右后肢腓肠肌组织，使用免疫组化法检测腓肠肌细胞Bcl-2及Bax蛋白基因的表达。结果：与对照组比较，缺血再灌注组及白芍总苷组腓肠肌细胞Bcl-2的IOD值皆更低、Bax的IOD值更高，Bcl-2/Bax比值更低（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，白芍总苷组非常肌细胞Bcl-2的IOD值升高、Bax的IOD值降低、Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05）。结论：白芍总苷通过调节Bcl-2家族蛋白，可减轻大鼠再灌注后的骨骼肌细胞损伤。
【关键词】白芍总苷；缺血再灌注损伤；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠；骨骼肌
【 Abstract 】 Objective: To study the effect of total glucosides of paeoniae paeoniae on the expression of Bcl-2 family proteins in rat skeletal muscle after ischemia/reperfusion injury. METHODS: Sixty healthy adult male SD rats were randomly divided into three groups: control group, ischemia reperfusion group and total glucosides of paeoniae paeoniae group, with 20 rats in each group. Rat skeletal muscle ischemia reperfusion model was established, with the exception of radix paeoniae alba total glycosides group rats lavage for half an hour prior to the infusion medicine radix paeoniae alba total glycosides of 240 mg/kg, the other two groups are at the same time by intraperitoneal injection of saline capacity; The rats were sacrificed 24 hours after perfusion, and the right hind gastrocnemius muscle tissues were collected. The expression of Bcl-2 and Bax protein genes in gastrocnemius cells were detected by immunohistochemical method. RESULTS: Compared with the control group, the IOD value of Bcl-2 was lower in ischemia-reperfusion group and total glucosides of paeoniae paeoniae group, the IOD value of Bax was higher, and the ratio of Bcl-2/Bax was lower (P < 0.05). Compared with the ischemia-reperfusion group, the IOD value of Bcl-2 was increased, the IOD value of Bax was decreased, and the ratio of Bcl-2/Bax was increased in the total glucosides of Paeonia lactiflora group (P < 0.05). CONCLUSIONS: Total glucosides of paeoniae paeoniae can alleviate skeletal muscle cell injury after reperfusion in rats by regulating Bcl-2 family proteins.
【 Key words 】 total glucosides of paeoniae paeoniae; Ischemia reperfusion injury; The Bcl - 2 protein; Bax protein; Rats; Skeletal muscle
骨骼肌是机体运动系统的重要组成器官，肢体缺血再灌注损伤常见于断肢再植术等外科手术[1]，表现为肢体严重的缺血与血运重建，白芍总苷是白芍的主要有效成分，存在抑制自身免疫反应、抗炎及抗氧化等多种生物学活性。有研究表明，在骨骼肌缺血再灌注损伤中存在着Bcl-2、Bax蛋白的异常表达，是细胞凋亡的主要因素[2]。基于以上，我们在本文实验中，通过建立大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤模型，探讨白芍总苷对大鼠模型Bcl-2、Bax蛋白表达的影响，以期为临床应用提供一定的实验基础。
1实验材料和方法
1.1实验材料
清洁级健康成年雄性SD大鼠，6~8周龄，总计60只。饲养在温度17~25℃、湿度35~50%的实验室中，保持环境的清洁、干净。实验前12h禁食。实验药物为白芍总苷胶囊（300mg/粒）。
1.2实验方法
1.2.1分组方法
60只实验大鼠按照随机分配随机分成三组：对照组、缺血再灌注组、白芍总苷组，各组大鼠计20只。对照组大鼠麻醉后不予以处理，在灌注前30min经腹腔注射生理盐水，再灌注时采集实验标本。缺血再灌注组大鼠麻醉之后建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型，灌注前30min经腹腔注射生理盐水，再灌注采集实验标本。白芍总苷组大鼠麻醉之后建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型，灌注前30min灌胃给药白芍总苷240mg/kg，再灌注时取得实验标本。
1.2.2模型制备
各组大鼠在手术前12h禁食，不禁水，建立大鼠肢体缺血再灌注模型：
1.2.2.1麻醉
经腹腔在各组大鼠相同位置给药，使用350mg/kg剂量的10%水合氯醛为麻醉药物，见大鼠全身瘫软，无眨眼、翻正等反射，同时固定四肢未见挣扎反应，说明麻醉成功。
1.2.2.2制备缺血再灌注模型
使用直径2.5~3.0cm的橡皮筋环扎大鼠右后肢（根部大转子处），环扎4圈，确保远端动脉搏动消失，即为缺血造模成功。在阻断右下肢血流4h之后撤掉橡皮筋，右爪皮肤颜色从紫红恢复为粉红，肢体远端能触及到动脉搏动，即为血流恢复。对照组大鼠麻醉之后不行环扎术阻断后肢血流。
白芍总苷组在环扎阻断血流后、再灌注前30min，灌胃给药白芍总苷240mg/kg；对照组与缺血再灌注组在相同时刻经腹腔注射同等剂量的生理盐水。
缺血再灌注模型制备成功后，将各组大鼠放回到鼠笼，依然常规饲养。
1.2.3采集标本
各组大鼠再灌注24h后，放血处死大鼠，右后肢行纵行切口，取腓肠肌组织，置于10%多聚甲醛溶液固定24h，制备石蜡切片，组织病理学检查与免疫组化检查，使用图像分析处理系统，对选取切片随机进行3个视野的摄像，测定组织切片当中骨骼肌细胞Bcl-2、Bax阳性细胞光密度值（IOD），并取3次平均值，反映Bcl-2、Bax蛋白表达，计算Bcl-2/Bax值。
1.3数据统计
使用SPSS25.0统计学软件做数据分析，采用均数±标准差的形式作为计量数据值的表达方式，使用t检验组间数据，结果P＜0.05即为结果有统计学意义。
2结果
2.1图像观察结果
肌纤维胞浆中有褐色颗粒表示Bcl-2阳性细胞。摄像观察到对照组大鼠腓肠肌组织中阳性细胞有较多数量，褐色颗粒在胞浆中呈密集状分布；缺血再灌注组大鼠中观察到阳性细胞少，褐色颗粒呈稀疏状分布；白芍总苷组大鼠观察到的阳性细胞要比缺血再灌注组多，褐色颗粒呈集中状分布。
2.2三组大鼠腓肠肌细胞Bcl-2、Bax表达
本实验中腓肠肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达以IOD值量化反映。与对照组比较，缺血再灌注组及白芍总苷组腓肠肌细胞Bcl-2的IOD值皆更低、Bax的IOD值更高，Bcl-2/Bax比值更低（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，白芍总苷组非常肌细胞Bcl-2的IOD值升高、Bax的IOD值降低、Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05），表1：
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注：与对照组比较，*P＜0.05；与缺血再灌注组比较，#P＜0.05
3讨论
3.1肢体缺血再灌注损伤与Bcl-2、Bax蛋白表达
关于骨骼肌细胞发生缺血再灌注损伤的机制，多项研究倾向于细胞凋亡机制参与其中。半胱氨酸蛋白酶家族蛋白中的半胱氨酸蛋白酶-3被认为是细胞凋亡的执行者[3]。
Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡内源性通路中积极参与，在Casepase的上游发挥调控作用，对细胞存亡加以影响[4]。另外，Bcl-2蛋白有抗氧化的重要作用，对细胞中的氧化还原反应有调节作用，可缓解缺血再灌注损伤时自由基造成的细胞损伤[5]。Bcl-2能够和Bax竞争结合，因此而形成的Bcl-2/Bax异源二聚体有利于减少Bax同源二聚体的大量形成。
实验中通过观察图像，发现缺血再灌注组大鼠的标本组织当中，经免疫组化染色的腓肠肌组织切片含有较多的Bax阳性细胞，而Bcl-2阳性细胞则比较少，提示在大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤中，骨骼肌细胞Bcl-2蛋白表达下调、Bax蛋白表达上调、两者比值降低，说明两者参与骨骼肌细胞损伤、并促使细胞凋亡。
3.2白芍总苷与骨骼肌缺血再灌注损伤
白芍总苷是芍药中的主要成分，有抗氧自由基的作用。实验表明，白芍总苷组大鼠腓肠肌组织中Bcl-2蛋白的IOD值较缺血再灌注组大鼠升高、Bax蛋白的IOD值降低，Bcl-2/Bax比值升高。说明白芍总苷的应用，有利于促进骨骼肌组织当中的Bcl-2蛋白优势表达，同时抑制Bax蛋白的表达，由此充分发挥出Bcl-2蛋白的抗凋亡效用，拮抗Bax的促凋亡，有利于缓解骨骼肌组织发生缺血再灌注损伤时受伤害程度；另外通过维持Bcl-2/Bax比值平衡，为细胞存活提供有利条件[6-7]。
综合以上实验分析，初步认为：白芍总苷通过调节Bcl-2家族蛋白，可减轻大鼠再灌注后的骨骼肌细胞损伤。
参考文献
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[3]李彬,温昱,杨新东.大鼠肢体缺血再灌注损伤后细胞凋亡与Bcl-2和Bax蛋白表达的关系[J].温州医学院学报,2003,33(5):301-303.
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山东省医药卫生科技发展计划项目（2019WS026）