刘晓俊
昆明市食品药品检验所 云南昆明 650032
摘要：目的 建立UPLC-MS/MS法同时测定大败毒胶囊中的芍药苷、绿原酸、橙皮苷3个成分的含有量。方法 Agilent poroshell 120 EC-C18（2.1mm×50mm,1.9μm）色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.02%甲酸水溶液，梯度洗脱，柱温为35℃，流速为0.2ml/min，进样量为5μl；电喷雾（ESI）离子源。结果 各组分在线性范围内线性关系良好，平均加样回收率98.1%-102.1%，RSD1.83%-4.42%。结论 该方法结果准确可靠，效率高，可为大败毒胶囊的质量控制研究提供科学依据。
关键词：大败毒胶囊；含量测定；绿原酸；芍药苷；橙皮苷；UPLC-MS/MS
大败毒胶囊内容物为黄褐色粉末，气腥，味苦涩；其成分包括陈皮、金银花、当归、赤芍、甘草等成分；具有清血败毒，消肿止痛的功能。收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成分制剂》第十二册[1]，原标准采用薄层色谱法对配方中的大黄和盐酸小檗进行鉴别，不能全面控制该制剂的质量，难以保证临床用药的安全性和有效性。
目前，相关研究主要是单一成分的含量考察[2～3]。为更有效的控制大败毒胶囊的质量，选择配方中的金银花、陈皮、赤芍3味药材的质量标志物绿原酸、橙皮苷、芍药苷来进行含量测定[4]。本实验建立UPLC-MS法测定大败毒胶囊中橙皮苷、绿原酸、芍药苷3个成分的含量，以期为提高大败毒胶囊的质量控制水平提供数据支持。
1.仪器与材料
Agilent 1290高效液相色谱仪，4000QTrap三重四级杆质谱仪，MS250DV型电子天平，SONOREX RK255型超声波清洗仪。橙皮苷（110721-201316，96.1%）、绿原酸（110753-201111，99.3%）、芍药苷（110736-201741，95.7%）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯。大败毒胶囊3批，规格均为0.5g/粒。
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1对照品的制备
精密称取橙皮苷、绿原酸、芍药苷对照品适量至10ml棕色容量瓶，用纯甲醇稀释定容制成对照品储备液；取对照品储备液适量至容量瓶中，用20%甲醇稀释成含绿原酸1.006μg.ml-1、橙皮苷1.084μg.ml-1、芍药苷2.19μg.ml-1的混合对照品母液备用。
2.1.2供试品溶液的制备
精密称取样品0.5g置于50ml棕色容量瓶中，加20%甲醇溶解超声30min,冷却后用20%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，精密移取0.5ml至10ml容量瓶中，用20%甲醇稀释定容至刻度线，摇匀，使用 0.22μm滤头滤过。
2.2色谱条件
Agilent poroshell 120 EC-C18（2.1mm×50mm,1.9μm），流动相为乙腈（A）-0.02%甲酸水溶液(B），梯度洗脱(0~0.35min，A:28.0%；0.35~3.0min，A:28.0%→90.0%；3.0~3.5min，A:90.0%→28.0%；3.5~6.0min，A:28.0%)，柱温35℃，流速为0.2ml.min-1，进样量为5μl。
2.3质谱条件
电喷雾（ESI）离子源，离子源温度为550℃，离子源电压为5.5kv, 雾化气55Psi，加热气55Psi，气帘气35Psi，负离子电离模式下进行扫描测定，芍药苷，绿原酸，橙皮苷3个成分的质谱离子参数如表1所示。
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2.4方法学验证
2.4.1线性关系考察
精密吸取“2.1.1”项下的混合对照品溶液0.25ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml分别到10ml的容量瓶中，加20%甲醇水溶液稀释定容，摇匀，制成一系列浓度的混合对照溶液，按照“2.2”、“2.3”项下条件进样。结果所得橙皮苷的线性回归方程为Y=3976.3512X+642911（r=0.99893）线性范围为：25.15 ng.ml-1～754.5 ng.ml-1；绿原酸的线性回归方程为Y=3729.8756X+6062.71（r=0.9963），线性范围为：27.025 ng.ml-1～810.75 ng.ml-1；芍药苷的线性回归方程为Y=919.9154X+37361（r=0.99802），线性范围为：54.75 ng.ml-1～1642.5 ng.ml-1。结果表明橙皮苷、绿原酸、芍药苷3个成分在各自线性范围内呈良好的线性关系。精密量取“2.1.1”项下的混合标准对照品溶液适量用20%甲醇水进逐级稀释进样，以信噪比S/N=3时所测得橙皮苷、绿原酸、芍药苷的检测下限分别为：0.000309 ng、0.000284 ng、0.0003589 ng；以信噪比S/N=10时测得橙皮苷、绿原酸、芍药苷的定量限分别为：0.001029 ng、0.0009459 ng、0.001196 ng。
2.4.2精密度试验
精密移取“2.1.1”项下的混合对照品溶液2ml至10ml容量瓶中，加20%甲醇水溶液稀释定容，摇匀，按照“2.2”、“2.3”项下的条件连续进样6次。结果表明橙皮苷、绿原酸、芍药苷峰面积的RSD分别为1.47%、1.97%、1.98%，RSD结果均小于2.0%，表明仪器精密度良好。
2.4.3重复性考察
取批号为Z22025517的大败毒胶囊样品6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”、“2.3”项下的条件分别进行进样测定，所得结果中6份样品中橙皮苷、绿原酸、芍药苷3个成分含量的RSD值分别为1.86%、1.95%、1.82%，RSD值均小于2%，表明在该方法重复性良好。
2.4.4加样回收率试验
取已知含量的大败毒胶囊样品6份（批号：Z22025517），每份约0.25g，加入对照品溶液适量，“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”、“2.3”项下条件进样，计算回收率。结果，橙皮苷、绿原酸、芍药苷的回收率分别为98.8%、102.1%、98.1%，RSD分别为1.83%、1.96%、4.42%。
2.5样品含量测定
精密称取3批不同批号的大败毒胶囊各2份，分别按照“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.2”、“2.3”项下的条件进样，计算3个成分含量，检测数据如表2所示，对照品和大败毒胶囊样品的色谱图见图1。
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3．讨论与结论
3.1含有量分析
样品的测定结果表明，不同厂家的大败毒胶囊中的橙皮苷与绿原酸含量差异最大为3倍、绿原酸含量差异最大的2倍，需要对大败毒胶囊中橙皮苷、绿原酸、芍药苷的含量进行测定，以更好的控制药品质量。原标准中对大败毒胶囊的检测只包含对大黄和盐酸小檗进行鉴别，而实验研究表明该标准不够完善，应该对大败毒胶囊中的橙皮苷、绿原酸、芍药苷的含量制定统一标准。
3.2流动相的选择
在试验过程中，还对比考察了乙腈-水、乙腈-0.02%甲酸水溶液几种流动相，结果表明在以乙腈(A)-0.02%甲酸水溶液（B）作为流动相时样品测定得到色谱峰峰型对称，分离度较好。
3.3提取方法的选择
本实验通过对同一批号的大败毒胶囊（批号Z22025517）进行超时时间30min、1h、2h的超声处理，结果表明超声时间超过30min对所测的3个成分含量无较大影响，为了节省时间和资源，我们选择了超声30min来对样品进行前处理。
3.4质谱条件的确定
本实验分别尝试了正、负离子模式采集数据，对比发现芍药苷无论在正离子模式还是负离子模式下，均有较好的响应值，而橙皮苷和绿原酸在负离子模式下，响应情况相对较好，因此选择了负离子模式进行测定。
3.5结论
本实验采用了超高效液相色谱-串联质谱法对大败毒胶囊中的橙皮苷、绿原酸、芍药苷3个成分的含量同时进行测定，测定结果显示，不同厂家的3个批次的大败毒胶囊中的橙皮苷、绿原酸、芍药苷的含量均有较大差异，需要对大败毒胶囊中的几个主要成分的含量进行控制。本实验所建立的方法所得结果准确可靠，重复性好，灵敏度高，效率高，节省了测定时间和实验试剂，可以为大败毒胶囊的质量控制和提升患者用药安全提供科学依据。
参考文献
[1]卫生部药品标准[S].中药成方制剂.第12册.1997.11
[2]高燚,李慧,陈闻燕,黄胜良,钱晓华,张丽. 大败毒胶囊质量标准的研究[J]. 中成药,2018,40(11):2450-2455.
[3]马家骅,谭承佳,曾彬,杨明. HPLC测定大败毒胶囊中芍药苷的含量[J]. 中成药,2008(02):303-304.
[4]李冉,齐芪,李赟,陈雪梅,盖颖. HPLC-MS/MS检测杜仲中绿原酸等4种活性成分的分析方法[J]. 北京林业大学学报,2016,38(06):123-129.
作者一姓名：刘晓俊；性别：男；出生年月：1986.11；籍贯云南省昆明市：（具体到市）民族汉族；最高学历硕士研究生：；目前职称：主管药师；研究方向：药品检验，化妆品检验