张建佩
酒钢集团甘肃祁牧乳业有限责任公司，甘肃，嘉峪关，735100
摘要：为了提高沙棘籽油的提取效率，最大程度的保持其活性成分，本文通过超声辅助水酶法提取沙棘籽中油脂，并确定最佳酶配比工艺，运用气相色谱-质谱联用技术分析其脂肪酸组成。结果表明：通过对复合酶比例的合理选择，提取沙棘籽油时间短、提油效率高。并对脂肪酸进行分析，棕榈酸、油酸、α-亚油酸、α-亚麻酸是沙棘籽油中的主要脂肪酸，其中α-亚油酸含量最高。
关键词：超声波；水酶法；沙棘籽油；响应面；脂肪酸
前言
沙棘籽油由沙棘籽经过超临界萃取或亚临界低温萃取得到的棕黄色到棕红色透明油状液体，集沙棘有效成分为一体的高度浓缩物。内含黄酮、有机酸、生物碱、甾醇类、三萜烯类及各种维生素等140多种生物活性成分[1]，在保健、医用方面，都有良好而稳定的功效[2]。
目前沙棘籽油的提取方法主要有压榨法、溶剂萃取法、超临界流体萃取法和水酶法。水酶法安全无毒，它是在萃取介质中加入酶，利用酶的高效专一性来酶解油料的细胞壁，促进细胞内成分的释放[3]，超声波技术能够加速传热和传质进程，在超声波的作用下，能够有效的破坏油料籽的细胞壁，并使细胞壁内的物质得到充分释放[4]。超声波辅助水酶法提取沙棘籽油不但高效、环保、节约，而且酶解条件温和，并可以得到优质的沙棘籽油。
本文采用超声波辅助水酶法提取沙棘籽油，通过单因素试验和响应面实验设计优化试验参数，明确提取沙棘籽油的最佳酶配比，确定沙棘籽油最佳提取工艺，并对其脂肪酸组分与索式提取法对比分析，为沙棘籽油的开发利用提供理论基础和技术依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 原料
沙棘籽
1.1.2 主要试剂
正己烷、无水乙醇、氢氧化钾、甲醇纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶。
1.1.3 主要设备及仪器
气质联用色谱仪、数控超声波清洗器、离心机、旋转蒸发器、植物组织粉碎机。
1.2 工艺流程
1.2.1超声波辅助水酶法提取沙棘籽油的工艺流程图
沙棘籽→预处理→粉碎→称重→料液配比→钝化→调节pH→超声波辅助复合酶法提取沙棘籽油→灭酶→有机溶剂萃取→离心分离→真空旋转蒸发→沙棘籽油
1.2.2 辅助方式的确定
称取10g预处理后的沙棘籽，在超声功率100W、料液比1：6、温度50℃、pH5.5，复合酶用量3%(果胶酶用量1%、中性蛋白酶用量1%、纤维素酶用量1%)的条件下研究3种协同方式对沙棘籽油提取率的影响。
（1）方式A
在料液比为1:6的沙棘籽中加入复合酶后超声波处理20min，酶解1h，90℃、5min灭酶[5-6]，测定沙棘籽油提取率。
（2）方式B
在相同条件的沙棘籽中加入复合酶超声波处理20min，90℃、5min灭酶，测定沙棘籽油提取率。
（3）方式C
在相同条件的沙棘籽中不加酶超声波处理20min，其他条件同上，测定沙棘籽油提取率。
1.2.3 复合酶配比的确定
取10g预处理的沙棘籽分别添加不同量的中性蛋白酶(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5% 、3%)、纤维素酶(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5% 、3%)、果胶酶(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%)，在其他条件相同的前提下，研究中性蛋白酶用量、纤维素酶用量、果胶酶用量对沙棘籽油提取率的影响。
1.2.4 复合酶配比响应面试验优化
利用Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取中性蛋白酶用量(A)、纤维素酶用量(B)、果胶酶用量(C)三因素进行编码，以沙棘籽油提取率为响应值，进行响应面分析，因素水平表见表1。
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1.2.5 沙棘籽油脂肪酸气相色谱-质谱分析
1.2.5.1 样品处理
参照GB/T 17376-2008《动植物油脂脂肪酸甲酯制备》中的方法对沙棘籽油进行脂肪酸的甲酯化。
1.2.5.2色谱条件
色谱柱：DB-23 石英毛细管柱（ 60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口：230 ℃，分流比 20:1；进样量：1 μL；载气为氦气，柱流速1 mL/min；升温程序：初温 140 ℃，保持 4 min，以3℃/min上升到230℃，保持10min。
1.2.6.3 质谱条件
离子源温度：230℃，四级杆温度 150 ℃，电子能量：70eV，扫描范围 15~550 m/z。
2 结果与分析
2.1 辅助方式的确定
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按照1.2.3中3种不同的辅助方式提取沙棘籽油，结果如图1所示，B处理方式所得的沙棘籽油提取率最高，为1.28%，所以采取方式B进行实验。
2.2 复合酶配比的确定
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图2表明，沙棘籽油的提取率随着蛋白酶用量的增加先升高后降低，当蛋白酶用量为1%时达到最高，籽油提取率为1.14%。
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图4表明，当果胶酶用量为1%时达到最高，沙棘籽油提取率为1.14%。
2.3 复合酶配比响应面试验优化结果与分析
2.3.1 响应面实验设计方案与结果
在单因素试验基础上，采用Box-Behnken设计原理，以沙棘籽油提取率为响应值，选取中性蛋白酶用量(A)、纤维素酶用量(B)、果胶酶用量(C) 进行三因素三水平响应面分析试验，响应面实验设计方案与结果见表2。
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2.3.2 模型的建立及显著性检验
采用Design-Expert.8.0.6软件对表2中的实验结果进行多元回归拟合，得到沙棘籽油提取率对中性蛋白酶用量(A)、纤维素酶用量（B)和果胶酶用量（C）的回归方程为：
Y=3.02+0.14A+0.09B+0.063C－0.07AB+0.015AC－0.015BC－0.25A2－0.065B2－0.064C2。对回归方程进行方差分析，见表3。
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由表3可以看出，各因素之间存在一定的交互作用，其中A、B、C、A2均呈极显著性影响，AB、B2、C2均呈显著影响，AC、BC影响不显著，因此各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。由P值可以看出，3个因素对沙棘籽油提取率影响大小顺序为：A（蛋白酶）>B（纤维素酶）>C（果胶酶）。
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由图5a可以看出，蛋白酶用量（A）与纤维素酶（B）的交互作用影响显著；由图5b和图5c可知，蛋白酶用量与果胶酶用量（C）的交互作用和纤维素酶用量与果胶酶用量的交互作用影响不显著。
由软件分析可知，沙棘籽油提取的最佳酶配比为：蛋白酶：纤维素酶：果胶酶为1.11%：1.26%：1.22%，在此条件下沙棘籽油提取率的理论值为3.08%。为检验试验设计的可靠性，对上述工艺条件进行验证，进行三次重复试验并取平均值，所得沙棘籽油提取率为2.99%，由t检验可知，P=0.213>0.05，试验验证值与理论预测值基本一致，表明理论预测值和真实值之间有很好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。
2.4 沙棘籽油脂肪酸组分分析
两种提取方法下的沙棘籽油经甲酯化后进行GC-MS分析，测定其脂肪酸组成，沙棘籽油的脂肪酸甲酯GC-MS总离子流色谱图见图6，分析结果见表4。
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经GC-MS分析，从沙棘籽油中共检测出17种脂肪酸，超声波辅助水酶法和索式法提取的沙棘籽油中饱和脂肪酸分别有9、8种，相对含量分别为15.99%、18.76%，不饱和脂肪酸均有7种，相对含量分别为84.01%、81.24%，其中多不饱和脂肪酸均有2种，相对含量分别为57.96%、56.39%，在超声波辅助水酶法提取的沙棘籽油中未检出山嵛酸，索式法提取的沙棘籽油中未检出6-甲基庚酸和癸酸。
表4 不同方法提取沙棘籽油的脂肪酸组分及相对含量
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由表4可以看出，棕榈酸、油酸、α-亚油酸和α-亚麻酸是沙棘籽油中的主要脂肪酸，超声波水酶法提取的沙棘籽油中主要脂肪酸的含量明显高于索式提取的，说明超声波水酶法较索式提取方法对沙棘籽油主要脂肪酸的损失较少，对人类健康更有益。
3 讨论
超声波辅助水酶法是在水酶法的基础上利用超声波在液体中产生的空化作用，能够在一定程度上加速油料细胞壁进一步遭到破坏，细胞壁内的物质得到释放，从而提高油料的提取率[7]。本试验运用单因素试验、响应面优化设计、SPSS软件方差分析等，获得了一个比较综合、客观的结果。
由于酶的专一性，单一酶很难将植物细胞彻底降解，因此需选择几种合适的酶混合使用，最大限度的破坏细胞结构。酶用量是直接影响工艺效果和经济成本的一项重要技术参数，一般认为，增加酶的用量，会提高出油率和分离效果，但也应适度，须根据油籽成分、提油方法等条件，经反复试验确定酶的种类和用量[8]。
4 结论
本试验相对索式提取沙棘籽油的方法，利用超声波作为辅助手段应用到水酶法中，在料液比为1:6的沙棘籽中加入复合酶超声波处理20min，90℃、5min灭酶，通过响应面分析，优化了最佳提取工艺为：其中蛋白酶用量为1.11%、纤维素酶用量为1.26%、果胶酶用量为1.22%，即蛋白酶：纤维素酶：果胶酶=1.11%：1.26%：1.22%，在此条件下沙棘籽油提取率的理论值为3.08%，试验验证值为2.99%。同时将沙棘籽油进行氢氧化钾-甲醇室温酯化法处理后作GC-MS分析，并与常规索式提取法提取的17种脂肪酸进行比较分析，考察了提取条件对各指标的影响，结果表明：棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸是沙棘籽油中的主要脂肪酸，超声波对沙棘籽油的品质及主要功效成分没有不利影响，油脂品质高。
参考文献
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[2] 李秋.沙棘果醋的研制及其成分分析[D].江南大学,2008.
[3] Campbell K,Glatz C,Johnson L,et al.Advances in aqueous extraction processing of soybeans[J]. Journal of the American Oil Chemists’Society,2011,88（4）:449-465.
[4] 孙月娥,王卫东,王举婷.水酶法从巴旦木中提油及水解蛋白研究[J].食品科学,2013,(02):72-77.
[5] 孙月娥,王卫东,王举婷.水酶法从巴旦木中提油及水解蛋白研究[J].食品科学,2013,(02):72-77.
[6] 马娇,陶海腾,徐同成,等.响应面法优化超声波辅助水酶法提取小麦胚芽油的研究[J].中国粮油学报,2013,(12):57-62.
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[8] 曾祥基. 水酶法制油工艺研究[J].成都大学学报,1996,15(l).