Xpert MTB/RIF 在福尔马林固定组织诊断结核病的应用

发表时间:2021/6/16   来源:《中国医学人文》2021年12期   作者:梁利斌 黎容 马华兰 胡兵 杨瑞仙 崔燕 邓芳
[导读] 目的:Xpert MTB/RIF在福尔马林固定组织诊断结核病的应用分析
        梁利斌1,黎容2,马华兰3,胡兵1,杨瑞仙1,崔燕1,邓芳4
        重庆市黔江中心医院:1.病理科;2.手术室;3.检验科;4.消化内科,重庆409099

        【摘要】目的:Xpert MTB/RIF在福尔马林固定组织诊断结核病的应用分析。方法:选取2018年1月-2020年6月重庆市黔江中心医院收治的首次就诊骨关节及淋巴结的疑似结核病患者88例作为研究对象。所有患者均通过穿刺或手术同时获取两份标本,一份新鲜标本经NALC-NAOH预处理,制成悬浊液;另一份经10%中性甲醛固定后制成福尔马林固定组织标本。新鲜标本进行MTB罗氏培养,福尔马林固定组织标本进行Xpert MTB/RIF检测。结果:(1)以最后临床确诊的80例结核病例为标准,Xpert检测及MTB罗氏培养检出结核分支杆菌的敏感度分别为92.5%(74/80)及66.25%(53/80)。Xpert检测的敏感度明显高于MTB罗氏培养。(2)在8例非结核病例中,Xpert检测及MTB罗氏培养均为阴性,特异度均为100%(8/8)。结论:对FFPE组织进行Xpert MTB/RIF检测具有耗时短、敏感性及特异性高的特点,值得在病理科对FFPE组织诊断结核的方法推广应用。
        【关键词】Xpert MTB/RIF;福尔马林固定组织;结核病


        结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病,是全球十大死亡原因之一,也是单一感染源导致的主要死亡原因。2016-2020年,中国是世界卫生组织定义的三类结核(结核、耐药结核以及HIV合并结核)高负担国家[1]。快速、准确的检测是预防、控制和治疗结核病的重要因素。
        结核标本主要有痰液、穿刺液等新鲜标本及福尔马林固定组织标本,病理科多为福尔马林固定组织标本。病理诊断素有“金标准”之称。然而,病理组织学形态不典型时,单纯根据形态不能确诊,必须借助实验室检查来辅助诊断。Xpert MTB/RIF是一种新型结核分子检测方法,具有生物安全性好,敏感度高,及检测时间短等特点,已逐步推广并应用于临床[2-3]。本研究以临床最后诊断作为标准,通过对比此技术与结核分枝杆菌(MTB)罗氏培养,探讨其在诊断结核中的价值。
1材料与方法
1.1临床资料
选取2018年1月-2020年6月重庆市黔江中心医院收治的首次就诊骨关节及淋巴结的疑似结核病患者88例作为研究对象。其中疑似淋巴结结核患者64例、疑似骨关节结核患者24例。男性30例、女性58例。
1.2 纳入标准
1.2.1 疑似淋巴结结核患者纳入标准,满足以下任意1条即纳入研究组:(1)体表肿大淋巴结经抗生素治疗两周及以上无效,同时伴有肺结核和/或其他部位结核;(2)淋巴结软化形成脓肿,影像提示淋巴结中央坏死;(3)外院穿刺提示淋巴结肉芽肿性炎。排除标准:已明确诊断为非淋巴结结核病患者。
1.2.2 疑似骨关节结核患者纳入标准,满足以下任意1条即纳入研究组:(1)关节周围有一个或多个窦道形成,有干酪样物渗出;(2)CT示软骨下死骨,无硬化及骨膜反应;(3)单关节肿痛、活动受限合并结核中毒症状;(4)单关节肿痛、活动受限,合并肺或其他部位结核;(5)关节周围冷脓肿;(6)X线片Phemister三联征,或出现“对吻“死骨、关节边缘无增生骨赘和硬化;(7)MRI滑膜增厚合并关节周围多发液性信号,软骨下骨广泛水肿信号或关节结构部分破坏;(8)血沉、C反应蛋白、降钙素原、白介素6等炎性指标明显增高;(9)结核免疫指标检测阳性;(10)系统抗结核治疗有效。排除标准:标本证实为其他细菌导致的化脓性感染。
1.3 方法  所有患者均通过穿刺或手术同时获取两份标本,一份新鲜标本经NALC-NAOH预处理,制成悬浊液;另一份经10%中性甲醛固定后制成福尔马林固定组织标本。新鲜标本进行MTB罗氏培养,福尔马林固定组织标本进行Xpert MTB/RIF检测。
1.3.1 MTB罗氏培养  采用美国BD公司生产BACTEC MGIT 960全自动分析仪,按标准操作程序进行分枝杆菌培养。同时阳性培养液接种至罗氏固体培养基,采用对硝基苯甲醛法鉴定结核分支杆菌(MTB)或非结核分枝杆菌(NTM)。具体操作步骤参照《结核病诊断细菌学检验规程》[4]进行。
1.3.2 Xpert MTB/RIF检测  采用美国Cepheid公司全自动GeneXpert仪器及Xpert MTB/RIF试剂盒。在一支微量离心管中加入6-12片5-10 um厚的FFPE切片,加入320 uL Deparaffinization solution,56oC孵育3 min,加入180 uL Buffer ATL,涡旋震荡,离心1分钟,加入20 uL Proteinase K到下部澄清的液相层中,56oC孵育至少1小时直至组织切片完全消化,90oC孵育1小时,进行简单离心,以下部澄清的液相作为下一步Xpert MTB/RIF检测的前处理样本。
取1mL前处理标本于有螺旋盖的无菌管中,然后加入2ml标本处理液,震荡20s后静置15min至标本完全溶解,利用移液枪将上清液转移至反应盒中,将反应试剂盒扫描二维码,录入信息,放入仪器中,2h后读取数据。
1.4 结核诊断标准:以临床最后综合诊断为标准。
1.4.1 淋巴结结核诊断标准[5]:满足下列任意1项即可诊断为结核:(1)病理学检查确诊;(2)结核分枝杆菌培养阳性;(3)疑似患者经诊断抗结核治疗有效。
1.4.2 骨关节结核诊断标准[6]:按照图1的诊断流程进行诊断

2 结果
2.1最后诊断结果 纳入研究64例疑似淋巴结结核患者,最后确诊淋巴结结核58例,非淋巴结结核6例,其中猫抓病性淋巴结炎2例,淋巴瘤伴肉芽肿样反应2例,结节病1例,非结核分枝杆菌性淋巴结炎1例。纳入研究24例疑似关节结核患者,最后确诊关节结核22例,非关节结核2例,其中类风湿关节炎及非典型分枝杆菌性关节炎各1例。
2.2两种方法检测时间  MTB罗氏培养20天-40天,平均35天。Xpert MTB/RIF检测用时均为2小时。
2.3两种方法在确诊结核病例中的检测结果 以最后临床确诊的80例结核病例为标准, Xpert检测及MTB罗氏培养检出结核分支杆菌的敏感度分别为92.5% (74/80)及66.25% (53/80)。Xpert检测的敏感度明显高于MTB罗氏培养。
2.4两种方法在确诊非结核病例中的检测结果 在8例非结核病例中,Xpert检测及MTB罗氏培养均为阴性,特异度均为100%( 8/8)。
3讨论
结核的病理学变化主要由于机体的反应性、菌量和毒力以及病变组织特性的不同而出现以渗出、增生或坏死为主的三种基本病变类型[7]。常以某一种或两种病变为主,但3种病变又以不同的比例混合存在,从而构成了结核病理形态的多样性。病理组织学检查确诊结核依据主要是伴干酪样坏死的肉芽肿。然而由于病理形态的多样性,相当一部分病例只有肉芽肿样改变,而无典型的干酪样坏死,其他非结核性疾病如结节病、真菌感染、肿瘤等也可以出现类似的肉芽肿,加上抗酸染色阳性检出率低,导致临床病理常无法做出确切诊断[8]。菌阴及病理不典型的病例往往是临床诊断的难点。
实验室检查是结核病重要的检查方法,常用的是MTB培养及抗酸染色镜检。MTB培养被认为是结核病诊断的“金标准” [9],但不能用于福尔马林固定组织,并且检测时间长,通常需要40天左右。抗酸染色镜检可用于FFPE组织,但敏感性低,经常造成假阴性, 尤其是FFPE组织切片,阳性率较痰液等体液标本的检出率低[10]。分子生物学检测是近年发展起来的检测方法,具有高特异性及敏感性的特点,可用于FFPE组织。目前常用的为传统PCR及荧光定量PCR方法,但需要建立有认证的PCR实验室才能开展,需要经过培训的专人才能操作,一般需要3天至1周时间得到报告结果,影响结果的因素较多,判读复杂,因此常有假阳性发生[11]。
Xpert MTB/RIF是2009年美国Cepheid公司研发的一种以半巢式实时定量PCR为技术基础,利用Xpert MTB/RIF平台同时检测MTB和利福平耐药的分子检测技术,检测时间仅需2小时。既往大量研究里,该技术已显示出在肺结核诊断的优异性能[12-13]。WHO于2010年推荐使用Xpert MTB/RIF 检测结核菌[14],于2013年推荐将Xpert技术用于肺外结核的诊断[15]。 Tadesse等应用Xpert MTB/RIF检测143例疑似淋巴结结核细针穿刺活检样本,以培养阳性或涂片阳性为金标准做比较,检测MTB的敏感性为87.8%,特异性为91.1%。本研究将疑似骨关节结核及疑似淋巴结结核病例进行前瞻性研究,以临床综合诊断作为标准,对Xpert MTB/RIF检测的诊断效能进行评价。在最后临床确诊结核80例中,Xpert MTB/RIF检测的敏感性高达92.5%,明显优于MTB罗氏培养的66.25%,而特异度无明显差别,均为100%。在时间上Xpert MTB/RIF检测只需要2小时即可完成,大大优于MTB罗氏培养的20天-40天。
综上所述,对FFPE组织进行Xpert MTB/RIF检测具有耗时短、敏感性及特异性高的特点,值得在病理科对FFPE组织诊断结核的方法推广应用。

参考文献
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[6]黄迅悟,李超.关节结核与耐药诊断专家共识[J].中国矫形外科杂志,2020,28(12):1057-1062.
[7]陈杰,周桥.病理学[M].北京:人民卫生出版社,2015:462-463.
[8]Krishna M,Gole SG.Comparison of conventional Ziel Neelsen method of acid fast bacilli with modified bleach method in tuberculous lymphadenitis[J].J Cytol,2017,34(4):188-192.
[9]余建林,彭琳,陈娟娟,等.结核病临床免疫学诊断的研究进展[J].实验与检验医学,2017,35(1):56-59.
[10]齐兴峰,郑智勇.结核分枝杆菌检测技术的研究进展[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(11):1263-1265.
[11]杨长绍,王丽,潘鑫艳,等.荧光定量PCR检测石蜡组织中结核分枝杆菌[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(3):321-323.
[12]Reechaipichitkul W,Phetsuriyawong A,Chaimanee P.Diagnostic test of sputum GeneXpert MTB/RIF for smear negative pulmonary tuberculosis[J].Southeast Asian J TropMed Public Health,2016,47(3):457-466.
[13]Singh M,Sethi GR,Mantan M,et al.Xpert(?)MTB/RIFassay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children[J]J.Int J Tuberc Lung Dis,2016,20(6):839-843.
[14]WHO report.Tuberculosis.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/
[15]World Health Organization.Using the Xpert MTB/RIF assay to detect pulmonary and extrapulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults and children:expert group meeting report(S].Geneva:World Health Organization,2013.
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