廖芳燕
南宁富莱欣生物科技有限公司 530003
摘要:研究 TTC 在保健食品菌落总数检测中作用和影响，确定最终TTC的合理浓度。方法: 采用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌3种不同菌株代表加入14个不同浓度的TTC培养基与不加TTC培养基的菌落生长情况进行了对比，并同国标方法结果进行对比。结果: 在平板计数琼脂培养基TTc浓度(1～2mg/100ml)为适宜浓度范围,可用于检测保健食品中菌落总数。
关键词: TTC,浓度,保健食品,菌落总数,检测
《GB 16740-2014食品安全国家标准 保健食品》对微生物指标有严格的限量要求,然而在保健食品微生物限量实际检测工作中, 由于细菌菌落颜色与琼脂底色相近,部分细小或生长于琼脂内部的菌落难以准确读出。此外,常遇到样品残渣微粒(特别是一些较难溶辅料如含乳制品类的蛋白粉等)与细菌菌落难以区分的问题,影响了细菌计数的准确性。
2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)在GB/T 4789.27《食品微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验》和2007版《化妆品卫生规范》中均为推荐试剂,可用于食品和化妆品中抗菌药物和细菌检测。但食品安全国家标准中涉及到微生物学检验的部分并没有要求加入TTC,可能考虑到有抑制作用导致计数结果偏低。用TTC使菌落显色的原理是细菌在代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将无色的TTC 还原为红色的三苯甲臢(TPF),使菌落变成红色;食品残渣则仍保持原色不变,从而将菌落与样品残渣微粒区分开来,以提高判数结果的准确性和可靠性。实际应用中,TTC添加浓度不当可能会影响细菌生长,从而影响细菌计数的准确性。因此确定TTC的使用浓度是保证检验结果准确性的重要前提,有相关研究认为TTC添加浓度为0.0008%～0.2%不等[1][2] [3],因TTC的添加浓度说法不一,影响因素较多,本试验以保健食品4大剂型(软胶囊、硬胶囊、片剂、粉剂)为试验样品,并添加大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌,加入TTC成不同浓度TTc的平板计数琼脂培养基分别进行试验,同时与国标法进行对比,研究不同TTc浓度平板计数琼脂培养基对存在样品残渣微粒保健食品菌落计数的影响,确定最适宜的TTC添加浓度,用于指导检测保健食品中菌落总数检测工作及给行业检验提供参考[4]。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌种与样品来源
大肠埃希氏菌(ATCC 25922)第三代、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)第三代、白色念球菌(ATCC 10231)第三代,均来自于广东环凯微生物科技有限公司。
试验样品(钙维生素D软胶囊,芦荟胶囊,多种维生素多种矿物质片,蛋白粉(保健食品))均由南宁富莱欣生物科技有限公司提供。
1.1.2主要仪器与试剂
二级生物安全柜BSC-1500IIB2-X: 济南鑫贝西生物技术有限公司;生化培养箱SPB-250: 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;漩涡振荡器:上海精密仪器仪表有限公司;电热恒温水浴锅HHSY11-Ni:上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
平板计数琼脂(CM101 ),北京陆桥技术股份有限公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(AR),广东师范大学化工厂;氯化钠,广东光华科技股份有限公司。
1.2方法
1.2.1工作菌株制备
将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌标准储存菌株,分别加入10mL胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中,于(36±1)℃培养18～24 h后划线胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板,对菌种纯度、形态特征及生化特征进行确认。将经确认的典型菌落作为工作菌株使用。
1.2.2 TTC平板计数琼脂制备
使用商品化平板计数琼脂(CM101),按培养基标签要求进行基础培养基的制备。待培养基冷却至47～50℃时,以无菌操作加入TTC溶液(4g/100mL),使100mL培养基含0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4,6,8,10,20,30,40mg TTC,混合均匀后置于(46±1)℃水浴锅中备用。
1.2.3含菌样品的制备
将4种工作菌液进行系列稀释,取10-4、10-5、10-6稀释度菌液各1 mL,分别加入试验样品中[钙维生素D软胶囊、芦荟胶囊、多种维生素多种矿物质片、蛋白粉(保健食品)],使最终样品菌含量在50CFU/g～200CFU/g之间。
1.2.4操作步骤
样品稀释、培养、菌落计数同《GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法。
2结果
2.1 大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌在不同浓度TTC平板计数琼脂生长情况,如表1所示。
.png)
注:1./表示TTC浓度为0%,即未添加TTC指示剂的样品;2.浓度在0.01 %～0.04%时无菌落生长。3.N表示不生长。
2.2大肠埃希氏菌在培养基TTc浓度(0.4～0.8mg/100ml)菌落生长良好,菌落颜色较浅呈淡粉色,指示作用不明显,菌落数量较对照组无明显差异;大肠埃希氏菌在培养基TTc浓度(1～10mg /100ml)时菌落生长良好,颜色呈粉红色到紫红色,有助于菌落辨认,且菌落数量较对照组无明显差异(Lg差小于r,r=0.25);当培养基TTc浓度（>20mg/100ml)菌落生长情况受到了不同程度的抑制,且菌落数量较对照组明显减少。
2.3金黄色葡萄球菌对TTC较敏感, 在培养基TTc浓度(0.4～0.8mg/100ml)菌落生长良好,菌落颜色较浅呈淡粉色,指示作用不明显,菌落数量较对照组无明显差异;金黄色葡萄球菌在培养基TTc浓度(1～2mg/100ml)菌落生长良好,颜色呈粉色到红色,菌落清晰可辨,且菌落数量较对照组无明显差异(Lg差小于r,r=0.25);当培养基TTc浓度(4～8mg/100ml)时菌落生长情况受到了明显的抑制,且菌落数量较对照组明显减少, 当培养基TTc浓度（>10mg/100ml)时金黄色葡萄球菌即被完全抑制不能生长。
2.4白色念珠菌在培养基TTc浓度(0.4～0.8mg/100ml)菌落生长良好,菌落颜色较浅呈淡粉色,指示作用不明显,菌落数量较对照组无明显差异;白色念珠菌在培养基TTc浓度(1～10mg/100ml)菌落生长良好,,颜色呈粉红色到紫红色,菌落清晰可辨,稍有点抑制,但菌落数量较对照组无明显差异(lg 差小于r,r=0.25); 当培养基TTc浓度（>10mg/100ml)时菌落生长情况受到了不同程度的抑制,且菌落数量较对照组明显减少。当培养基TTc浓度（>20mg/100ml)时白色念珠菌即被完全抑制不能生长。
2.5小结
通过2.1-2.4试验,使用TTC平板计数法对保健食品4大剂型(软胶囊、硬胶囊、片剂、粉剂)中大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌分别进行试验,结果显示：培养基TTc浓度(0.8mg/100ml以下)菌落不显红色,TTC 已不能起染色作用,因此也失去了其使用价值。在培养基TTc浓度(1～2mg/100ml)为适宜浓度范围,在该浓度下能很好的使菌落显色,同时又不会抑制细菌生长。
2.6准确度
使用国标方法及平板计数琼脂培养基TTC浓度(2mg/100 mL)分别对25组人工污染的典型保健食品(样品菌含量在1000CFU/g～5000CFU/g之间)进行菌落总数测定,利用T检验法分析检测结果的准确度,T临界值=2.06( a=0.05),T计算值=0.054,T计算值<T临界值,两组数据无显著差异,如表5所示。
.png)
3结论与讨论
在食品加工、储存、运输、销售过程中,任一环节均可能造成食品被细菌污染,造成菌落总数超标。根据保健食品生产加工特征及既往细菌检测结果,本研究选取革兰氏阴性菌代表种-大肠埃希氏菌;革兰氏阳性菌代表种-金黄色葡萄球菌(代表葡萄球菌属);白色念珠菌(真菌种代表);霉菌菌落形态明显无需考察。试验于平板计数琼脂培养基中加入不同浓度的TTc,通过对14种培养基TTc浓度(0～40mg/100 mL)培养基的检测发现:上述3种常见细菌对TTC的敏感性不同。其中 TTC指示剂对革兰氏阳性菌的抑制性较革兰氏阴性菌略强。其中金黄色葡萄球菌对TTC最为敏感,当培养基TTc浓度(0.2～2mg/100 mL)时菌落生长良好,当培养基TTc浓度时(>4mg/100 mL)即会对金黄色葡萄球菌产生不同程度的抑制。大肠埃希氏菌、白色念珠菌在培养基TTc浓度(0.2～0.8mg/100ml)时生长良好,当培养基TTc浓度(>10mg/100ml)时产生不同程度的抑制甚至不生长。本次试验证明在培养基中加入适当浓度的TTC能够易于鉴别菌落,并且不影响细菌本身的生长繁殖。通过2.1-2.4试验表明, 在培养基TTc浓度(1～2mg/100ml)为适宜浓度范围。本试验经过国标方法及平板计数琼脂培养基TTC浓度(2mg/100 mL)相比,菌落在TTC平板计数琼脂上呈粉红色至红色,部分芽孢菌落还会产生红色中心,在检测成分复杂的保健食品样品时有助于菌落的辨认,能够提高检验人员菌落计数的准确性,可用于检测保健食品中菌落总数。
参考文献
[1]张军成,2,3,5-三苯基氯化四氮唑浓度对细菌菌落总数测定的影响.江苏省涟水县疾病预防控制中心.卫生检验与实验研究,2016年7月第27卷第4期
[2]杨庆文,国译丹,周惠新,等.不同浓度TTC平板计数琼脂细菌生长试验观察[J.中国卫生检验杂志,2012,22(1):62—63.
[3]李学兴 石 琳 梁 伟,不同浓度TTC在微生物检测培养基中的应用.云南省玉溪市食品药品检验所.科技分析与检测,食品安全导刊 2017年12月
[4]宋白薇,戴岚,TTC应用于食品菌落计数的探讨.江苏省苏州出入境检验检疫局. 上海预防医学杂志2002年第14卷第12期
作者简介:廖芳燕(1985—),女(汉),药学专业,研究方向:保健食品微生物学。