张超
天津农学院 天津 300384
摘要：由于锌离子在人体细胞中广泛分布，在人体代谢过程中起着重要作用，特异性检测和监测锌离子浓度具有重要意义。荧光探针因其设计简单、操作方便、灵敏度高、可用于细胞成像等优点，在锌离子检测中得到了广泛的应用。荧光锌探针一般根据光诱导电子转移、分子内电荷转移、荧光共振能量转移、聚集诱导发射和螯合增强荧光等机制构建。本文对近年来报道的荧光锌探针进行了简要的综述。
关键词：锌离子；识别机理；荧光探针
引言
锌在人体内是第二多的过渡金属元素，其广泛存在于人体细胞内，在细胞新陈代谢，基因表达，机体免疫和神经传输等活动中起着重要作用[1, 2]。锌浓度的变化经常预示着某些疾病，如锌离子水平过高或过低可能导致酶活性失调，基因表达错误，神经传递受阻等生理紊乱现象[3]。因此，锌离子的有效检测和监控对相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。在多种检测方法中，荧光探针具有廉价易得，操作简单，灵敏度高，可实时监测等诸多优点，已广泛用于锌离子的选择性识别和检测。依据荧光信号的变化，锌离子荧光探针可分为三个大类：荧光猝灭型，荧光增强型和比率型。荧光猝灭型探针，即探针分子自身拥有荧光，与锌离子反应之后，荧光发生猝灭，通过荧光从有到无的过程检测锌离子的存在。由于造成荧光猝灭的因素很多，尤其是在生物环境中，荧光信号受到的影响更为复杂，锌离子的存在并非荧光猝灭的唯一因素，因此荧光猝灭型探针的与此实用性较差[4]。比率型锌离子荧光探针是以两个不同波长处荧光强度的比值作为响应信号以测定锌离子含量，具有自校正的特点，可消除光源强度和仪器灵敏度的影响，并具有较高的精确度和灵敏度，近年来多见报道[5]。荧光增强型锌离子探针，其机理是探针分子本身不发出荧光或自身荧光较弱，与锌离子结合之后，荧光显著增强，通过荧光强度与锌离子浓度的线性关系实现定性，定量检测，该类型探针具有更好的特定与灵敏度，应用广泛[6, 7]。因此，本文只收录后两种机制的文章。
典型的荧光探针通常由三个部分组成，即识别基团（作用基团），连接基团和荧光团（信号基团）。其中，识别基团实现探针与检测对象的选择性作用，连接基团将识别基团和荧光团相连接，而信号基团则产生可观察的荧光信号。目前，文献中已报道多种不同类型的锌离子荧光探针，这些探针对锌离子的识别机理主要包括：光致电子转移（(photo-induced electron transfe，PED）、分子内电荷转移（Intramolecular charge transfer，ICT）、荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）、聚集诱导荧光增强（Aggregation induced fluorescence enhancement，AIE）和螯合荧光增强（Chelating fluorescence was enhanced，CHEF）等[8-10]。本文将以文献报道的锌离子为例，介绍基于各类识别机理的锌离子荧光探针及其设计思路。
1 基于不同机理的锌离子荧光探针
1.1 基于PET机理的锌离子荧光探针
PET作用是设计、构建锌离子探针最常用的识别机理之一，其识别原理为：探针分子与锌离子作用前，其荧光团与识别基团的轨道能级处于匹配状态，当荧光团基态电子受光激发跃迁到激发态时，识别基团上Ｎ原子等的孤对电子会转移至荧光团的HOMO轨道，使得荧光团处于激发态的电子无法通过辐射光子的途径回到基态，从而淬灭其荧光；与锌等金属离子作用后，识别基团的轨道能级发生改变，上述电子转移过程无法发生，即ＰＥＴ作用被阻断，从而恢复探针分子荧光。
美国麻省理工学院的Lippaid教授课题组以二吡啶甲基胺（DPA）为识别基团，荧光素为荧光团，构建了一系列性能优异的ＰＥＴ型锌离子探针[11-14]。这些探针分子具有类似的结构特点，即均以二吡啶甲基胺及其衍生物为识别基团，通过亚甲基将该类基团非共轭地连接在荧光素等荧光团上。
Hirano[15]等基于PET机理, 以荧光素衍生物为荧光团, 大环多聚胺环为识别基团, 合成了探针6-羟基-9-[4-(4, 7, 10-三甲基-1, 4, 7, 10-四氮杂环十二烷基)]-苯基-3H-氧杂蒽-3-酮(ACF-1)和其2, 7-二氯衍生物(ACF-2) (图1-a)。当Zn2+结合到大环多聚胺环后, 导致PET受阻, 荧光增强。5μ M Zn2+的加入, 使ACF-1(5μ M)和ACF-2(5μ M)的荧光强度分别增强14倍和26倍。这类探针对Cu2+的结合常数比Zn2+大, 但Cu2+与ACFs的结合物无荧光, 所以很容易辨别, 且其在一定浓度范围内受其他金属离子的干扰较小, 具有一定的价值。然而由于ACFs是利用大环的多聚胺环接受Zn2+, 结合速度非常慢, 需要100min, 因此未应用到生物体系中。为提高ACFs的结合速率和低量子产率, 将N, N, N', N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺引入到荧光素基团上作为Zn2+的识别基团, 可合成ZnAF-1(图1-b)和ZnAF-2(图1-c)[16]。在pH值7.5的溶液中, 加入Zn2+后, ZnAF-1和ZnAF-2的荧光强度分别增强17倍和51倍, 检测限达到亚纳摩级, 可将其用于检测哺乳细胞。结合Zn2+后, 虽然ZnAF-1的荧光增强倍数不如ZnAF-2, 但ZnAF-1受Cd2+的影响比ZnAF-2小。此类探针受pH的影响较大, 当pH< 7.0时, 由于酚羟基基团的质子化, 导致结合物的荧光强度降低, 所以ZnAFs不太适合于在微酸性条件下对Zn2+的检测。为了进一步提高ZnAFs系列探针的性能, 减少其受pH的影响, 在其酚羟基的邻位上引入能降低其pKa值的吸电子基F, 合成了探针ZnAF-1F(图1-d)和ZnAF-2F(图1-e), 结合Zn2+之后, 2种探针的荧光强度分别增强69倍和60倍[17]。ZnAF-2F不具有细胞渗透性, 但可利用它与乙酸酐和碳酸铯反应生成ZnAF-2DA。ZnAF-2DA具有亲油脂性, 可以透过细胞, 然后在细胞脂酶的作用下转变成ZnAF-2, 所以ZnAF-2DA可以作为探针测定细胞中的Zn2+。上述探针均为比较经典的以荧光素为母体的Zn2+荧光探针, 当Zn2+与识别基团相结合时, 主要通过抑制其PET过程实现对Zn2+的检测。
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潘胜南等人设计并合成了一种新型香豆素Schiff碱荧光探针7-羟基香豆素-3-羧酸酯-8-甲醛苯甲酰hydr（EBH）[18]，它显示了依赖溶剂的双重传感，即在DMF-H 2 O中识别Ca 2+（91：1，V / V）溶液基于C = N异构化，光致电子转移（PET）抑制和螯合增强荧光（CHEF）机理以及H 2 O-CH 3 OH 中Zn 2+的检测（ 91：1，V / V）溶液通过激发态分子内质子转移和CHEF过程。
1.2 基于ICT机理的锌离子荧光探针
自1996年第1次接在荧光素上后, N, N-二(2-吡啶甲基)胺 (N, N-di-2-picolylamine, DPA) 基团在锌离子荧光探针的设计中得到广泛应用。DPA能提供 3个氮原子, 是明确的Zn2+配体。Du等以8-氨基喹啉为母核, 以DPA为识别基团合成了荧光探针QZn1。探针结合Zn2+后, 由于酰胺结构的去质子化和分子内电荷转移 ICT机理导致荧光量子产率增加以及荧光发射波长从407 nm红移至499 nm。I499nm/I407nm比率值在一定范围内随着Zn2+浓度的增加而增加, 此比率型荧光探针可应用在环境和生物方面。
Wei等[19]合成了一种N-吡啶亚胺基萘酚结构的Zn2+荧光探针Schiff-B2。此探针具有双功能识别作用, 可用于Zn2+的荧光法检测, 也可用于Fe3+的比色法检测。此探针可以实现对Zn2+的可逆性结合, 加入EDTA后, Zn2+被释放, 荧光淬灭。其对Fe3+的选择性归因于抑制了萘酚的O-H和N=CH基团之间的ICT, 而对Zn2+的选择性是通过与分子中O和N杂原子的结合而产生的。
1.3 基于ＦＲＥＴ机理的锌离子荧光探针
Han等[20]基于荧光共振能量转移机理合成了Zn2+比率型荧光探针R（如图2）。其包括荧光素和罗丹明2个荧光团, 分别作为能量供体和受体, 很好的避免了比率型荧光探针设计时, 单荧光团易引起得荧光发射峰重叠的问题, 而且荧光素的发射波长与罗丹明的吸收波长能很好的匹配, 满足FRET机理发生的条件。在4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic aci, HEPES]缓冲溶液中, 未加入Z n2+时, 罗丹明以β 内酰化结构存在, 在可见光区无吸收, 不能作为能量受体, 485nm光照下, 只发射荧光素518nm的绿色荧光。然而, 加入Zn2+后, 导致罗丹明开环, 在560nm处有能量吸收, 能量的转移使518nm处荧光素的发射峰减弱, 590nm处罗丹明的发射峰增强, 具有比率型荧光探针的特点。
图2
1.4 基于AIE机理的锌离子荧光探针
唐本忠等提出的AIE机理[21]大大拓展了有机染料在水溶液中的应用空间。由于具有某些特定结构的有机染料在水中易聚集，并伴随显著的荧光增强效应，使得原本疏水的有机染料同样可以很好地应用于含水溶剂体系。AIE机理已广泛应用于锌离子荧光探针的构建。为设计、构建AIE型锌离子探针，最简单的方法是将锌离子识别基团连接到具有AIE特性的荧光团上。
唐本忠等[22]将两个锌离子识别基团三联吡啶通过苯环共轭连接到AIE “明星分子”四苯基乙烯两端，构建了具有AIE性质的锌离子荧光探针。该探针分子在ＴＨＦ溶液中没有明显荧光，而在THF/H2O的混合溶剂体系中则呈现出荧光，并且随着水含量的增加而不断增强，说明该探针具有明显的AIE性质。其溶液与不同金属离子作用时，只有加入锌离子，才会诱使探针分子聚集，荧光显著增强并且红移，因此可用于锌离子的选择性识别。
1.5 基于CHEF机理的锌离子荧光探针
螯合荧光增强（CHEF），自1900年由Czarnik等[23]提出后，便受到人们的广泛关注，大量基于此类作用的锌离子荧光探针相继报道。基于上述几种机理构建的锌离子探针通常具有荧光探针的典型结构特征，即同时含有识别基团、连接基团和荧光团。而基于CHEF机理的探针，其识别基团往往可以同时作为荧光团，因此，CHEF型锌离子探针通常具有结构简单，设计、合成简便等优点[24]。
Wallace等[25]将两个芘单元分别以邻位和间位方式连接到苯环上，得到两种锌离子探针30和31（图3），探针30与锌离子反应后，荧光增强幅度较小，而探针31则对锌离子表现出较大幅度的荧光增强响应，当以325nm波长激发时，400nm处出现较强的荧光发射峰。分子力学计算结果表明，探针分子30及31中均存在堆积相互作用，且两化合物的堆积作用有所不同，探针30中的一个芘单元插入堆积夹层形成一种三明治型相互作用，而探针31分子因两个芘单元距离较远，没有形成这种三明治型相互作用，所以表现出较强的荧光响应。探针31中的两个O原子和两个N原子均与锌离子发生配位螯合作用，使荧光显著增强。
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2 结论与展望
锌离子荧光探针具有价格低廉、设计简单、操作简便、灵敏度高、可实时监控等优点。可基于光致电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）、聚集诱导荧光增强（AIE）和螯合荧光增强（CHEF）等多种不同机理设计、构建锌离子荧光探针，实现对锌离子高选择性、高灵敏度以及细胞内检测。本文结合具体实例，按不同机理简单介绍了锌离子荧光探针的设计、构建与性能。由于篇幅有限，很多性能优异的探针无法一一介绍。
虽然锌离子荧光探针的研究已取得很多突出的成果，但是还有很多方面需要进一步改进、提高。例如，与Zn２＋外层电子排布相似的Cd２＋以及顺磁性的Cu２＋对锌离子识别造成的干扰往往较为严重。通过合理修饰探针分子结构，进一步改善其选择性是今后重要的努力方向。
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