瞿新营
汉高股份有限公司 上海市 200000
摘要：采用萃取与超高效液相色谱与电喷雾四极杆飞行时间串联质谱联用法（UPLC-QTOF-MS）对固化胶黏剂中的添加剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）及其钠盐进行分析。首先考察了萃取流程的优化，确认了先采用少量THF溶胀已经剪碎的样品，然后再用三氯化铁作水溶液萃取，EDTA-2Na可以被络合成EDTA-Fe而被萃取到水溶液中，可以获得较高的萃取效率。以三氯化铁作为络合剂，并应用了色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSST3柱（2.1mm×100mm，1.8μm），流动相采用甲醇和水（10mM/L 醋酸铵）的梯度洗脱，柱温40℃，大气压喷雾电离源，负离子采集模式，离子源温度为120℃。结果表明形成的络合物乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）峰有很好的信号，测定的乙二胺四乙酸二钠在5000μg/L 浓度范围内峰面积与浓度呈良好线性关系（r = 0.9998）。本法提供了固化胶中EDTA的提取检测方法，采用三氯化铁络合的方法萃取以及后续UPLC-XTOF-MS定性和定量检测，优化得到的萃取流程和色谱质谱条件可以拓展应用于其他固体基质中EDTA-2NA的定性与定量检测。
关键词： 超高效液相色谱－四极杆飞行时间串联质谱；HSST3柱；固化胶黏剂；三氯化铁；溶剂萃取；定量分析
Determination of Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) in cured adhesive matrix by UPLC-QTOF-MS
Abstract: A new method for determination of Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) and its sodium salts in cured adhesive matrix by extraction and ultra performance hydrophilic interaction liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time of flight /mass spectrometry (UPLC-QTOF-MS) was developed. Firstly, the solvent extraction pr℃edure was optimized, low amount of Tetrahydrofuran (THF) was applied to swell the small pieces of the cured samples, then the complexing agent trichloride ferric water solution was applied as chelation and extraction agent, EDTA was successfully transformed to EDTA-Fe and extracted into the water solution. For UPLC-QTOF-MS test, also trichloride ferric water solution was used as complexing agent, the separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC HSST3 (2.1 mm × 100mm，1.8 μm) and the mobile phase were acetonitrile with ammonium acetate solution (10mM·L-1) and LCMS water for gradient elution. The column oven was maintained at 40℃. The mass spectrometry ion source was equipped with an negative mode ESI under the temperature of 120 ℃. According to the results, the characteristics peaks of EDTA-Fe was determined with UPLC-QTOF-MS. The calibration curve of EDTA-Fe was linear in the range of 5000 μg·/L (r=0. 9998). The optimized solvent extraction pr℃edure as well as chromatographic conditions can be applied to the qualitative and quantitative UPLC-QTOF-MS detection．And the method can be extended to more solid polymer matrix for EDTA detection with UPLC-QTOF-MS equipment.
Key words: UPLC-QTOF-MS；HSST3 column；cured adhesives；trichloride ferric water solution；solvent extraction；quantitative analysis
EDTA（Ethylene diamine tetraacetic acid），乙二胺四乙酸的分子式为C10H16N2O8，分子结构如图1所示，是一种白色、无味、无臭的结晶性粉末。它不溶于冷水、乙醇、酸和一般有机溶剂，能溶于氢氧化钠、碳酸钠和氨溶液。由于EDTA可以与碱金属、稀土金属和过渡金属等形成极稳定的水溶性络合物，而且其碱金属盐能溶于水，EDTA作为螯合剂被广泛应用于水处理、洗涤剂、纺织、造纸、医药、橡胶加工、照相等多个领域。EDTA 盐产品主要包括EDTA二钠盐、EDTA 四钠盐、EDTA 三钠盐，以它们为原料，还可以生成EDTA 钙钠盐、EDTA 铜钠盐、EDTA 铁钠盐和EDTA 铁铵盐等。EDTA钠盐的水溶性较好，EDTA 及其二钠盐能与多种金属离子发生络合反应，形成稳定的环状结构，有效地减少或抑制金属离子引起的副反应或有害作用，目前是应用最为广泛的金属螯合剂。
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胶黏剂行业中，EDTA及其盐类的也可以作为一种有效的金属螯合剂添加到产品中。EDTA及其盐类的含量是否均匀也会在一定程度上会影响到胶的固化程度，因此其含量的测定很有必要。对于EDTA及其盐类的检测，已经有相关研究报道[1-9], 其中高效液相色谱方法已经广发应用在食品以及医药检测中，一般采用Cu2+和Fe3+ 作为络合反应的金属离子，根据文献报道乙二胺四乙酸二钠与Cu2+ 形成络合物的稳定常数为1018.7，而与Fe3+可形成更为稳定的螯合物，稳定常数为1024.2[10], 因此本文采用稳定常数更高的Fe3+为螯合剂，即三氯化铁作为络合反应剂来进行萃取和后续检测。借鉴食品以及药品中乙二胺四乙酸二钠的检测方法，本文探索了固化胶黏剂中乙二胺四乙酸二钠的萃取工艺并采用UPLC-QTOF-MS检测方法，建立的方法可以拓展应用到材料中乙二胺四乙酸二钠的检测。
1 仪器与试剂
Waters UPLC XEVO G2 QTOF 液质联用仪超声仪，（奥宗尼尔，
M4-1030），Mettler Toledo XS205 电子天平，四氢呋喃（THF，无抑制剂，上海安普实验科技股份有限公司HPLC级别），水（Fisher，LCMS级别），甲醇、乙腈（上海安普实验科技股份有限公司，LCMS级别），乙二胺四乙酸二钠标准品（>99.9%，德国标准品，莱耀生物提供），无水三氯化铁（>99.9%，阿拉丁），2ml一次性针筒（上海安普实验科技股份有限公司）。
2 UPLC-QTOF-MS样品溶液的制备
2.1 三氯化铁溶液的制备
用无水氯化铁制备1000mg/L的水溶液，然后加水稀释制取100mg/L的三氯化铁溶液，置10mL棕色容量瓶中。
2.2 乙二胺四乙酸二钠标准品溶液
取乙二胺四乙酸二钠标准品50mg置50mL 棕色容量瓶中，加LCMS水溶解，摇匀并定容至50ml获得1000mg/L的EDTS-2Na标准溶液。精确量取上述溶液5ml，置50mL 棕色量瓶瓶中，加水定容至50ml并摇匀获取100mg/L的EDTA-2Na标准溶液。然后精确量取上述100mg/L的EDTA-2Na标准溶液2mL，置10mL棕色容量瓶中，加0.1mLof 100mg/L的三氯化铁溶液，加水定容到10ml刻度并摇匀，静置30分钟后过滤处理（0.22μm 聚醚砜滤膜，取滤液获得2mg/L的EDTA-Fe标准溶液， 继续用此溶液加水稀释获取100μg/L，500μg/L，1000μg/L，2000μg/L，5000μg/L的EDTA-Fe标准溶液。
2.3 固化胶中EDTA及其盐的萃取实验
将已经固化的样品裁剪成碎片（<3mm3mm）, 然后称取大约400mg样品放到20ml玻璃瓶中，加入2ml四氢呋喃，超声处理20分钟，静置浸泡过夜。然后加入8ml LCMS水并超声处理10分钟，向以上溶液中加入0.1ml 100mg/L的三氯化铁溶液并超声处理10分钟，取其中的溶液过滤后稀释5-10倍后加入LCMS样品瓶中。
3 定性鉴定方法
3.1 超高压液相条件色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC HSST3柱（1.8um, 2.1*100mm）；流动相：（A）甲醇，（B）Fisher LCMS 级别水（10mM mol/L醋酸铵），梯度洗脱（0～5min，50%A→99%A；5～12min，99%A；12～15min，99%A→50%A；柱温：40℃；流速：0.2mL·min-1；进样量： 1μL。
3.2 质谱条件： 离子源为ESI源；负离子检测方式；源压：2.5kV；一级锥孔电压：40V；二级锥孔电压：4.0V；源温：120℃；脱溶剂温度：550℃；脱溶剂气流速： 800L·h；一级质谱全扫描，扫描范围：50～1200m/z。
3.3 质谱扫描：选择在全离子扫描方式下，测试样品提取的一级质谱图中出现与标准品相同的准分子离子峰［EDTA-Fe］-4H，（m/z 343.9943） ，结构式如图2所示，以此峰为定性检测质谱信号。
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4 定量测试
4.1 超高压液相色谱条件和质谱条件同以上 3 中内容。
4.2 外标法定量测试
将上述 2.2制备的100μg/L，500μg/L，1000μg/L，2000μg/L，5000μg/L的EDTA-Fe标准溶液进样UPLC-QTOF-MS检测，将获得的EDTA-Fe峰面积对乙二胺四乙酸二钠浓度做线性回归，回归方程为：Y = 8.275 X － 101.918， r = 0.9998，结果如图3、图4所示。乙二胺四乙酸二钠在5000μg/L 浓度范围内峰面积与浓度呈良好线性关系。
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4.3 精密度以及重复性测试
用2.2中制备的100mg/L的EDTA-Fe标准溶液稀释获得100μg/L、600μg/L以及 3500μg/L 的EDTA-Fe标准溶液，分别连续进样3次，记录EDTA-Fe络合物色谱峰，经过核算获得保留时间的RSD大约为0.14%，峰面积RSD为0.61%，表明仪器精密度可靠，重复性良好。
4.4 稳定性试验
用2.2中制备的100mg/L的EDTA-Fe标准溶液稀释获得100μg/L、3500μg/L的EDTA-Fe标准溶液，在室温下放置3小时，6小时以及12 小时，按3中的色谱质谱条件测定样品中EDTA-Fe的含量，记录EDTA-Fe色谱峰面积。另外分别考察柱温35℃，40℃，45℃的测试结果，记录EDTA-Fe色谱峰面积。结果显示测试时间的RSD为0.11%，温度的RSD为0.53%，测试样品在12小时内稳定，柱温的小幅度波动不会对检测结果有影响，仪器稳定性良好。
4.5 回收率验证测试
实验室自制胶黏剂并在其中加入三组固定量（100μg/L, 600μg/L, 3500μg/L）的EDTA螯合剂。固化后，按照2.3中步骤萃取制备样品溶液，按照本实验方法进行回收率测定，每个添加水平重复测定6次，获得其回收率。结果显示本方法中乙二胺四乙酸二钠在不同浓度的回收率为92.1%~94.4%, 相对标准偏差大约为8.67%。
4.6 检测限和定量限
采用信噪比法，以信噪比3:1时相应浓度作为检测限，以信噪比10:1时相应浓度作为定量限，重复测试三次。测得本法的检测限和定量限分别为30μg/L和100μg/L.
5 实验结果与讨论
5.1 固化胶中样品的萃取
固化胶难以再溶解，本法将样品经过剪碎处理，样品剪碎程度对测试结果的影响也进行了系统的考察，发现未经过剪碎处理的样品萃取率极低，样品碎片经过处理，平均尺寸小于3mm3mm时对萃取率的提升已经不明显，因此确定样品尺寸大小不超过3mm3mm为宜。
将处理好的样品碎片进行了直接水萃取，与加四氢呋喃浸泡后再进行水萃取的结果进行对比，直接水萃取的样品萃取率明显低于后者。由于四氢呋喃能够溶胀固化的样品碎片，而后续加入的水可与四氢呋喃互溶，使得萃取剂及络合剂水溶液容易进入样品内部，样品中的目标物更加充分地被萃取出来。
5.2 络合剂浓度的考察
向经过四氢呋喃浸泡处理的样品溶液中分别添加0.05ml, 0.1ml, 0.2ml, 0.3ml, 0.4ml 100mg/L 的三氯化铁溶液并超声处理10分钟，取其中的溶液过滤后稀释5-10倍后加入LCMS样品瓶中。结果显示，除了0.05ml三氯化铁样品测试的EDTA-Fe络合物的峰面积数值微低，其余的不同添加量的样品中测得的EDTA-Fe络合物的峰面积没有明显差异，过剩的三氯化铁存在并没有影响测试结果，因此本法采用添加0.1ml 100mg/L三氯化铁溶液，可以保证乙二胺四乙酸二钠被络合完全。
5.3 色谱柱的选择
对于乙二胺四乙酸及其二钠盐的测定，已有的文献报道较多地采用高效液相色谱法在254nm波长采集数据，为了解决乙二胺四乙酸络合物极性强在色谱柱上保留弱的问题，用常规C18、C8等色谱柱时，流动相中要加入磷酸盐等缓冲罐液调节PH在4左右。但在这个条件下负电模式的质谱就无法获得较好的信号。也有文献报道采用waters HILIC色谱柱，可以增强强极性化合物的保留[8]。本方法考察了极性化合物专用柱ACQUITY UPLC HSST3 (1.8um, 2.1*100mm)，低C18 配基密度，通过减少 C18 的覆盖率最大程度上增加保留。在HSST3柱中可以采用乙腈/水或者甲醇/水体系作为流动相，比较了两种流动相对出峰保留以及峰形的影响，最终确定采用甲醇/水体系。HSST3柱可采用较大比例的水相最大程度上增加保留，试验中考察了甲醇（10mM/L醋酸铵）、水的比例调整，最终确定了3.1中的色谱条件，在此条件下EDTA-Fe络合物可以获得适当的保留和满意的峰形。
6 结语
本实验将络合萃取技术和UPLC-QTOF-MS技术相结合，开发了一种测定固化胶黏剂中EDTA-2Na的方法，本方法考察的样品前处理萃取流程和色谱质谱条件可以拓展应用于其他固体基质中EDTA-2NA的定性与定量检测。
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简介：瞿新营；1983.06，女，汉族，上海市闵行区人，浙江大学，博士学历，生物化工，从事胶黏剂产品开发，胶黏剂行业分析测试工作十多年，参与研发多种高性能胶黏剂工作。