张冰松
柳州市中医医院（柳州市壮医医院）, 广西 柳州545000
【摘要】目的 探讨酶联免疫吸附法（ELISA）检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg）假阳性的影响因素及解决方法。方法 选取2019 年8月— 2020年8月来我院治疗的 320 例疑似乙肝病毒携带者血清样本，均用ELISA法检测，分析检测结果及出现假阳性的原因。结果 共13例出现假阳性，初检假阳性原因最高为标本溶血，占比6.98%，其次为标本离心不全与洗版影响，其他因素包括显色条件、试剂盒质量、操作不当等。结论 运用ELISA法检测HBsAg，检测结果会受到许多因素影响，应当对样本检测的各个环节做好质量控制，以提高检测精准性。
【关键词】 乙肝病毒表面抗原（HBsAg） 酶联免疫吸附法（ELISA） 假阳性 影响因素
引言 乙型肝炎（乙肝）在临床上为常见疾病，对患者的健康造成很大危害，严重时可危及生命，因此通过一种有效的方法对乙肝患者实施诊断就显得极为重要。 运用酶联免疫吸附法（ELISA）检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg）是对乙肝患者实施诊断的一种主要方法。然而实践研究发现，ELISA法检测HBsAg会有假阳性的情况。本文分析ELISA检测HBsAg假阳性的影响因素并提出解决办法。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2018年10月至2019年10月来我院治疗的320例疑似乙肝病毒携带者血清样本，其中男185例，女135例，年龄21岁至72岁，平均年龄（46.5±3.1）岁。
1.2 仪器与试剂 仪器使用深圳爱康AE145全自动酶免仪，试剂使用珠海丽珠HBsAg 酶联免疫试剂盒、上海科华HBsAg 酶联免疫试剂盒以及配套试剂。
1.3 方法 用不同厂家HBsAg酶联免疫试剂盒进行样本检测与复检，ELISA定性试验按照试剂盒说明操作，同时使用弱阳性质控物质进行室内质控，先使用珠海丽珠试剂进行初检，然后使用上海科华试剂和定量法对 HBsAg 初检阳性样本进行复检，结合初检与复检结果判断最终结果。
1.4 评价标准[1] ①初检阳性，两次复检均为阴性，结果判定为阴性（即初检为假阳性）；②初检阳性，复检均为阳性，结果判定为阳性；③初检阳性，复检显示其中一项为阴性，则采用初检试剂进行第二次复检，复检结果为阴性则判定为阴性（即初检为假阳性）。必要时进行HBV-DNA确认。
2 结果
2.1 初检及复检结果 ELISA法初检显示HBsAg阳性86例，占比为26.87%。对86例初检阳性标本进行复检，用上海科华试剂复检显示13例阳性样本经定量检测均为阴性，再次使用初检试剂进行复检显示 13 例均为阴性，即该 13 例判定为初检假阳性，假阳性率 15.12%。
2.2 假阳性原因分析 分析结果显示出现初检假阳性 原因最高为标本溶血，占比 6.98%，其次为试剂盒质量与操作不当影响，其他因素包括离心不全、洗板影响、显色条件。 （见表1）
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3 讨论
在不同类型的肝炎中，乙肝的危害性最大，其传染性、病毒性都极大。通常情况下，乙肝病毒入侵机体 1-2周后才会产生乙肝表面抗原[2] ，为感染乙肝病毒后最先出现的血清标志物；同时，乙肝HBsAg也是判定乙肝病毒感染的重要参考指标。乙肝HBsAg的构成成分是 Dane 颗粒的外壳、球型颗粒以及管型颗粒，其中球型颗粒的直径达22 nm。一般来说，急性肝炎、慢性肝炎或者没有表征的病毒携带者 HBsAg 都会呈阳性。然而，在临床中，需要高度关注以下情况：当处于急性感染的恢复阶段会有核心窗口期的情况，也就是说，此阶段中 HBsAg 消退，而抗-HBs尚未产生，这个阶段可以仅持续数日，也可以维持几个月[3]。临床运用酶联免疫吸附法、胶体金标法、化学发光微粒免疫法（CMIA）等手段检测乙肝HBsAg，胶体金法的特点是快速检测，主要用于急诊，而此方法的不足是有很高的漏检或误检风险，同时弱阳性的检测概率也很高；CMIA 法属于免疫分析技术，需要在封闭的情况下实施，要配齐全自动仪器和配套试剂，其优势在于灵敏度与特异性高，最大程度地减少人为因素对检测结果的影响，而此方法所使用的试剂成本高，一般运用确认弱阳性反应性样本；ELISA法操作简单，快速检测，灵敏度高，特异性较好，被临床普遍用来检测乙肝HBsAg。然而，同一个人在不同医院接受HBsAg检测，其检测结果会存在差异，甚至于同一样本于同一检验室检测，其检测结果也会有所区别。运用 ELISA 法检测时，若其中某个步骤发生问题，都会对最终检测结果造成影响，产生假阳性或假阴性的错误判断[4，5]。为此，在实际检测中，一定要遵循说明书开展，认真细致检测每份样本，复查存在质疑的检测结果，保证其精准度，防止有假阳性与假阴性的错误判定。与此同时，要有效评估实验室，控制室内质量。本文分析了320例疑似乙肝病毒携带者血清样本ELISA检测乙肝HBsAg检测结果及出现假阳性影响因素，结果显示，初检假阳性原因最高为标本溶血，占比6.98%，其次为标本离心不全与洗版影响，其他因素包括显色条件、试剂盒质量、操作不当等。分析导致检测结果呈假阳性的影响因素及解决办法：①标本溶血：标本溶血后血清中含有血红蛋白，血红蛋白中的冶铁血红素存在一定的过氧化物酶活性，其能够与包被抗体结合，采用一步法进行洗脱时难以完全洗脱，其残留的过氧化物酶催化底物四甲基联苯胺可导致假阳性的出现。②离心不全：血液凝固不全或者血清没有完全析出就加入标本进行检测，从而导致检测反应孔发生凝血现象；或者受到残留细胞成分的干扰，血清中的补体可与IgG 的 Fe 段相结合，血浆纤维蛋白与酶结合物容易一起黏附于ELISA 检测板上，洗脱不易，免疫球蛋白的聚合物、免疫复合物容易吸附到塑料表面，形成非特异性吸附，进而引起假阳性。③洗板与显色影响：洗涤剂浓度配制不当，洗板机堵孔，残留液较多等因素导致本底增高，洗板不彻底，进而出现假阳性。温度与时间对于显色具有非常重要的影响，温度37 ℃时，显色深浅随着时间的增加而加深。④试剂盒质量：本次研究结果显示试剂盒因素导致假阳性 1 例，珠海丽珠试剂盒初检假阳性，与国内 ELISA 试剂盒临界值设置偏低有关。⑤操作不当：样本量不准确，加错标本，标本因操作不当造成污染，未加入包被孔底物都可能导致 HBsAg 假阳性。本次分析因标本受污染导致1例初检假阳性。为了取得更加精准的检测结果，降低假阳性风险，最大程度上减少ELISA检测的误差，需要从下列方面进行改进：①为了解决标本溶血问题，要求受检者空腹采血，血清完全分离，避免纤维蛋白丝混入。遇到尿毒症患者血液标本需要将析出的血清放入到干净管内，凝固几分钟后剥离纤维蛋白，重复 3 次不再凝固便可检测。②选择卫生部批准的合格试剂盒产品，试剂盒保存温度为2~8 ℃，并且每日做好记录，避免频繁开关。③加样量一定要准确，并且加样一定要加到孔底部，标本轻拿轻放，避免外溅造成交叉污染。加样时严格避免纤维蛋白或红细胞被吸取，以防止上述物质影响检测结果，既而判断失误。④分离血清时，增加离心转速，拉长离心时间，防止离心受到纤维蛋白以及红细胞的影响，让离心标本充分分离。⑤严格按照说明进行操作，显色时间与室温要控制合适，水温控制在37 ℃。⑥加热样本进行处置，或者待样本隔夜后再行检测，保证样本血块浓缩，以使其中的非特异性活性物质丧失全部或部分活性，减少因异物所引发的假阳性结果产生。
综上所述，运用ELISA法检测乙肝HBsAg时，务必严格遵循操作流程，做好各个环节的质量控制，防止人为原因导致诊断失误，避免假阳性的情况产生，从而提高诊断精准度。
参考文献
[1] 努尔比亚·阿布都热西提，米亚塞尔·买买提伊敏.酶联免疫吸附法 检测乙肝病毒表面抗原假阳性的影响因素分析[J].世界最新医学信息文摘，2016，16（01）：157，159.
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[3] 秦健雪. 电化学发光免疫分析法与酶联免疫吸附胶体金测定低浓 度 HBsAg 的评价[J].基层医学论坛，2016，20（11）：1503-1504.
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[5] 金刚. 不同免疫检验方法检测乙肝病毒感染血清标志物的效果[J]. 临床医学研究与实践，2019，4（28）：121-122.