庞雪原 林晶
中山大学附属第三医院 广东省广州市 510000
[摘要] 目的：从粪便中分离、培养和检测病原菌，对于临床治疗及预后调查有一定的价值。粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等，各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辨是否为病原菌。此次我们主要分离培养并鉴定粪便标本中的大肠埃希菌和痢疾志贺菌[3]。方法：本文利用伊红美蓝平板培养后的菌落特征，再提纯培养细菌进行革兰染色镜检、动力实验、生化反应。可鉴定粪便标本中的病原菌。
[关键词] 革兰染色 大肠埃希菌 志贺菌 分离培养 鉴定
1.实验材料与仪器
1.1标本：粪便标本
1.2培养基：普通琼脂平板、伊红美蓝平板、营养琼脂斜面培养基、营养肉汤液体培养基、半固体琼脂培养基
1.3试剂：细菌干粉培养基革兰染色法[1]试剂【结晶紫、碘酒、95%乙醇、稀释复红】、糖发酵管【乳糖、葡萄糖】、褔氏志贺菌诊断血清。
1.4仪器：接种环、接种针、酒精灯、试管架、恒温培养箱、显微镜、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁尔灭、灭菌平皿、刻度吸管、吸水纸、橡皮筋。
2.实验过程
2.1细菌的分离与培养
细菌分离培养：伊红美蓝平板分区划线分离（5区）。
无菌操作取粪便标本于固体平板培养基上，采用分区画线分离法培养细菌。于37℃培养24小时，从而分离出单个菌落。
2.2细菌群体生长特征的观察
观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。
粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径2～3mm。淡粉红色菌落，半透明，直径1～2mm。
2.3细菌纯培养
粪便标本在伊红蓝平板上，有紫黑色，粉红色两种菌落。分别挑选这两种菌落在斜面培养基上接种标记，在37℃培养24h。
2.3.1斜面接种法
选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落在平皿底部玻璃上，画个大圈选择菌落，右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，再用灭菌的接种环套住菌落，轻刮取菌，将其伸入代接斜面试管底部，轻轻向上划线，接接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上，观察斜面培养基。
2.3.2营养肉汤接种
其操作步骤基本与斜面接种时相同，不同之处是挑取菌体的接种环放入液体培养基后，应在体液表面处的管内壁上轻轻摩擦，使菌体从环上脱落，混进培养基，塞好试管塞后，摇动液体，使菌体在液体中分布均匀，或用试管振荡器混匀。
2.4细菌的形态学检查
2.4.1细菌涂片标本制备
采用斜面培养基的少量细菌涂抹在洁净载玻片的生理盐水上，涂抹成直径1厘米大小的均匀薄膜，自然于干燥后利用外焰固定。从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。
2.4.2革兰染色方法
涂片→干燥→固定→结晶紫初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇脱色约20秒钟→水洗→稀释复红→复染1分钟→水洗→吸干，油镜观察。
2.4.3动力试验
用半固体穿刺接种法（接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部的4/5处，再循原来的路线推出接种针）做细菌的动力试验，在37℃培养24h观察结果。
2.4.4生化反应
通过无菌操作，用灭菌接种针刮取细菌培养物少许，分别接种在葡萄糖微量管和乳糖发酵微量管内。将微量管平放在平皿盖内，37℃培养过夜后观察结果。
2.4.5痢疾诊断血清玻片凝集试验
取载玻片两张分别滴加痢疾杆菌诊断血清和生理盐水各15ul。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果。
3.结果观察、分析、总结
3.1粪便中的细菌在伊红美蓝平板上的菌落特征
结果显示，粪便标本在伊红美蓝平板上形成了紫黑色跟粉红色两种菌落。紫黑色细菌：长杆状、粉红色。粉红色细菌：短杆状粉红色，较紫黑色细菌粗大。
3.3半固体穿刺接种法
紫黑色的菌落自接种部位向周围移动扩散生长，使培养基呈扩散云雾状混浊状态。粉红色的菌落只能沿着穿刺线生长繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。
3.4生化反应试验结果如下
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3.5痢疾诊断血清玻片凝集实验结果
粉色的菌苔和痢疾杆菌诊断血清的混合悬液由均匀混浊,并出现大小不等的乳白色颗粒团块即阳性。
紫黑色的菌苔与生理盐水的混合悬液不能产生颗粒固块即阴性。
4．结论
采用平板划线分离法，从浓汁标本中分离出黄色和白色两种菌落。显微镜下，这两株细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；结合菌落或菌苔颜色，这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过血浆凝固酶试验鉴别，金黄色葡萄球菌是致病菌。
用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，它们都是G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，半固体动力试验，血清学试验结果鉴定，它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌。
由菌落形态观察、染色镜检、生化及动力试验结果可初步判定标本中所得到的紫色菌落为非致病大肠埃希菌，粉红色透明菌落为致病痢疾志贺菌。
参考文献：
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