西藏山南市浪卡子县多却乡人民政府
摘要：探讨IL-18与猪接触性胸膜肺炎发生的关系。方法：小鼠经滴鼻感染半致死剂量的App，48小时后宰杀，观察肺部的病理变化。取肺部病变组织一部分用于总RNA提取，另一部分用于组织病理学观察。组织病理学研究采用常规石蜡切片，HE染色，显微镜下观察。IL-18表达的检测采用RT-PCR和qPCR的方法进行。结果：感染小鼠剖检可见肺部呈鲜红色，有弥漫性出血，同时可见有坏死灶，有些有纤维素性增生，包心包肝。组织病理学观察发现，感染小鼠肺泡结构消失，细末支气管附近有广泛的细胞损伤，气管的柱状上皮细胞结构破坏，气管内有炎细胞浸润；肺静脉血管扩张，肺泡间质有红细胞浸润；肺上皮细胞损伤，肺泡壁细胞坏死脱落，肺泡内有浆液。炎症灶周围有大量炎细胞聚集，包括：巨噬细胞，淋巴细胞，和中性粒细胞，其中以中性粒细胞浸润为主。
关键词：IL-18表达；猪接触性胸膜肺炎；qPCR；RT-PCR；小鼠
前言
猪接触性胸膜肺炎与IL-18相关，白细胞介素18(IL-18)是IL-1细胞因子家族成员,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌,其基因结构、合成表达、受体与信号转导等方面比较特殊,IL-18具有多种生物学功能,特别是具有诱导产生IFN-C的强大功能,它在先天及后天的免疫应答调节中发挥重要作用,在刺激T细胞增殖、增强Th1型反应、细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞等活性,抗肿瘤、免疫调节等方面有着积极的作用。对IL-18的生物学特性的研究发现,它在某些疾病病理状态,包括自身免疫及感染中作为潜在的效应因子而发挥调节作用[2]。
白细胞介素18作为一种新发现的天然免疫调节剂,目前已被公认为是一种可以替代传统疗法的新型治疗剂和有效的免疫佐剂,已经成为研究热点[3]。1995年,发现从腹腔注射痤疮丙酸杆菌和LPS导致内毒素休克的小鼠肝脏中成功分离到IL-18。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌种来源：猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型由湖南农业大学动物医学院余兴龙教授惠赠。
1.1.2培养基：胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）购自青岛日水生物技术有限公司。无支原体超级新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。NAD氧化型辅酶Ⅰ购自北京鼎国生物技术有限公司。
1.1.3主要试剂：TRNzol总RNA提取试剂、PCR反应用试剂（2×Taq PCR Master Mix）、DNA标准分子量（D2000 Maker）购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒、荧光定量qPCR用SYBR® Green I试剂购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司。
1.2动物感染模型的建立和组织病理学观察
实验用昆明小鼠，4周龄，重18-22g，清洁级，共12只，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠随机分为两组，每组6只。实验组用致死剂量菌液（1×1011CFU）滴鼻感染小鼠，对照组生理盐水滴鼻。感染后随时观察小鼠临床症状的变化和死亡情况。感染后 48h（致死剂量半数致死时间）宰杀存活小鼠，取肺，一部分用于总RNA提取，一部分采用10%的福尔马林固定，用于组织病理学观察。组织病理学观察以常规石蜡切片H-E染色进行。
1.3引物
根据文献和GenBank已发表的小鼠的IL-18基因序列设计特异性引物（表1）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1.目的基因的引物序列和扩增片段长度
Table 1. PCR primer sequences and length of target genes in this study
1.4半定量RT-PCR
按TRNzol总RNA提取试剂说明书从组织中提取总RNA。按反转录试剂盒的说明书合成cDNA第一链。PCR反应条件：94℃ 预变性5 min；然后94℃变性 30 s， IL-18的退火温度为55℃，退火时间均为30 s，72℃ 延伸1 min，共26个循环；最后72℃ 延伸7 min。扩增完成后，分别取5µL的PCR产物，于1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照后利用Quantity One 软件进行条带峰面积灰度扫描，计算所测基因和ß-actin扩增条带峰面积灰度之比以评定所测基因的表达水平。
1.5荧光实时定量PCR
荧光实时定量PCR(qPCR)采用CFX96系统荧光定量PCR仪分析。按SYBR® Green I试剂说明进行操作。qPCR条件：95℃ 30s 1个循环；95℃ 15s，60℃ 30s，40个循坏。记录并分析荧光信号，与内参β-actin比较，根据比值分析所测基因的表达水平。
1.6数据的处理
数据以平均值±标准差（SD）(x±s )表示，采用单因素方差分析判断差异显著性。
2结果和分析
2.1眼观和组织病理学观察
小鼠攻毒感染后，48h内未见死亡。但实验小鼠表现为挤堆，双眼微闭，被毛粗乱，精神沉郁，不采食，呼吸急促等症状。剖检可见肺部呈鲜红色，有弥漫性出血，同时可见有坏死灶，有些有纤维素性增生，包心包肝。组织病理学观察发现（图1），感染小鼠肺泡结构消失，细末支气管附近有广泛的细胞损伤，气管的柱状上皮细胞结构破坏，气管内有炎细胞浸润；肺静脉血管扩张，肺泡间质有红细胞浸润；肺上皮细胞损伤，肺泡壁细胞坏死脱落，肺泡内有浆液。炎症灶周围有大量炎细胞聚集，包括：巨噬细胞，淋巴细胞，和中性粒细胞，其中以中性粒细胞浸润为主。
2.2肺部组织RNA的提取
实验组和对照组的提取的肺部RNA有明显的28S、18S和5S 3条带。说明样品RNA未呈现降。
3讨论
感染小鼠剖检可见肺部呈鲜红色，有弥漫性出血，同时可见有坏死灶，有些有纤维素性增生，包心包肝。组织病理学观察发现，感染小鼠肺泡结构消失，细末支气管附近有广泛的细胞损伤，气管的柱状上皮细胞结构破坏，气管内有炎细胞浸润；肺静脉血管扩张，肺泡间质有红细胞浸润；肺上皮细胞损伤，肺泡壁细胞坏死脱落，肺泡内有浆液。炎症灶周围有大量炎细胞聚集，包括：巨噬细胞，淋巴细胞，和中性粒细胞，其中以中性粒细胞浸润为主。小鼠感染猪胸膜肺炎放线杆菌后IL-18基因表达增高。
参考文献
[1]Markus EN,Susetta Finotto,Laurie H,et al. The role ofThl / Th2 polarization inmucosal immunity[J]. Nature. 2004,8(6): 567-573.
[2]Komine 0,Hayashi K,Natsume W, et al. The Runxl transcription factorinhibits the differentiation of naive CD4^ T cell into the Th2 lineage by reparessingGATA3 expression[J]. J Exp Med. 2003, 198 (1): 51-61.
[3]Pandey A,Mann M. Proteomics to study genes and genonies[J].Nature,2000,405:837-46.