罗维晓 马冠初 徐振上 于福朋 刘新利*
齐鲁工业大学生物工程学院/生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东 济南 250353
摘要：【目的】建立一种稳定有效的非灭活型病毒运输培养基，探索该培养基组成的最佳条件。【方法】在Hank，s平衡盐溶液的基础上，通过控制变量法探索PH值、稳定剂、氨基酸、抑菌剂对该培养基性能的影响。【结果】非灭活型病毒运输培养基PH值在7.1-7.4条件下添加10%的牛血清白蛋白，分别添加1mmol/L的丝氨酸和胱氨酸非必需氨基酸有利于病毒保存的稳定性，抗生素类抑菌剂优于常规化学类抑菌剂，多重抗生素联合使用对于培养基抑菌效果更佳。【结论】优化条件后的非灭活型病毒运输培养基在自身稳定性和病毒保存效方面效果较好，为病毒的运输培养基商品化提供可能。
关键词：非灭活型病毒，运输培养基，条件优化，稳定性
Optimization of Non-inactivated Virus Transport Medium Conditions
LUO Weixiao XU Zhenshang MA Guanchu YU Fupeng LIU Xinli*
(School of Bioengineering，Qilu University of Technology / State Key Laboratory of Bio-based Materials and Green Paper Making，Jinan 250353，China )
Abstract: [Objiective]To establish a stable and effective non-inactivated virus transport medium and explore the best conditions for the non-inactivated transport medium. [Methods] On the basis of Hank's balanced salt solution, the influence of pH value, stabilizers, amino acids, and bacteriostatic agents on the performance of the medium was explored by the method of controlling variables. [Results]The pH value of the non-inactivated virus transport medium is added with 10% BAS under the condition of 7.1-7.4, and the non-essential amino acids of 1mmol/L serine and cystine are added respectively to facilitate the stability of virus storage, and antibiotics are excellent. Compared with conventional chemical antibacterial agents, the combined use of multiple antibiotics has better antibacterial effect on the culture medium. [Conclusion] The optimized non-inactivated virus transport medium has better effects in terms of its own stability and virus preservation efficiency, which provides the possibility for the commercialization of virus transport medium.
Keywords：Non-inactivated Virus, Transport Medium, Condition Optimizing, Stability
前言
随着近几年病毒感染疫情的爆发，对于病毒的核酸检测需求越来越大，采样运输是保证检测有效性的重要开端，病毒采样的方式众多，其中使用运输培养基进行采样运输是一种高效的采样方式[1-2]，运输培养基一般配合采样设备来进行使用（鼻拭子或咽试子）[3]，样本从采样地运送到检测实验室就需要病毒运输培养基来进行运输，由于样本采集和运输的环境一般在常温下进行，因此对于运输培养基本身的要求也非常高[4-5]。
目前临床实验室中常用的运输培养基有灭活型和非灭活型两种病毒运输培养基[6]，灭活型病毒运输培养基优点是安全性高，但是由于目前灭活的方法多采用极高浓度的胍盐或者表面活性剂进行灭活，一方面会影响后期核酸提取和核酸检测的结果，另一方面灭活剂中容易分解核酸，导致临床中多出现假阴性的情况；而非灭活型病毒运输培养基，主要是以Hank’s平衡盐为基础进行改良的病毒维持液型培养基[7-8,13]，类似的病毒培养基也有相关的报道[9-12]，由于该类培养基不含裂解盐，保存的病毒完整性更好，检测结果更准确，但是目前已有的非灭活型病毒运输培养基多出现自身生菌被污染的情况，急需要对该培养基自身的稳定性和培养效果方面进行改进和优化，本文以此为出发点探索非灭活型病毒运输培养基的最佳条件，为病毒运输培养基提供更优质的商品化产品提供可能。
1材料与方法
1.1实验材料
Hank’s平衡盐含酚红（noble-Rder）、牛血清白蛋白BSA（Amresco）、硫酸庆大霉素、氯霉素、头孢菌素购于克拉马尔公司，制霉菌素、两性霉素B购于生工生物，盐酸万古霉素（上海西宝生物）、多粘菌素E硫酸盐（上海瑞永生物）、牛莎BND-10（晶茂生物）、牛莎PC-8020（晶茂生物），叠氮化钠、ProClin??300、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸均购于sigma、蔗糖、葡萄糖、PEG2000 、PEG6000 、甘油、氢氧化钠、盐酸、碳酸钠均购于国药试剂， 海藻糖（苏州亚科生物）,二硫苏糖醇（MIT）购于罗氏；
1.2实验设备
十万分之一分析天平（赛多利斯）、生化培养箱（山东博科）、B2型生物安全柜（山东博科）、超净工作台（山东博科）、压力蒸汽灭菌器（新华医疗）、0.22 μm过滤器（ANOW）、酸度计（雷磁），核酸提取仪器及配套试剂（山东博科），荧光定量PCR（Roche），移液器（eppendorf）；
1.3实验样本
实验所用的病毒样本是来自济南市第六人民医院丙型肝炎病毒样本4.27×105 copies/mL (正常参考范围：0-1000 copies/mL)；
实验用的细菌、真菌：
革兰氏阳性菌选用：金黄色葡萄球菌（ATCD25922）
革兰氏阴性菌选用：大肠埃希氏菌 (ATCC25923)
真菌选用： 白色念珠菌(CMCC(B)98001)
1.4培养基的配置方法
在Hank’s平衡盐溶液（含有酚红）的基础上，分别添加不同种类和不同浓度的稳定剂，调整不同的PH值、选择最适的非必需氨基酸以及使用抑菌剂的种类分别进行实验，以验证最适的培养条件。
培养基的配置在10 万级洁净环境下百级的洁净台中进行过滤分装，在每配置完成一种溶液后使用0.22 μm的过滤器进行过滤，以去除必要的杂质和大部分的微生物。
1.5培养基效果的验证
非灭活病毒运输培养基经过相应的运输培养后，进行病毒样本的提取和基因扩增，核酸的提取和PCR实验均在标有二级生物安全的PCR实验在中进行操作。
2结果与分析
2.1最适pH值的实验探索
在Hank’s基础培养液基础PH值范围分别使用5.6%的碳酸钠缓冲液调整到6.5、6.8、7.1、7.4、7.7、8.0、8.3、8.6、8.9、9.2，选取10 个不同的pH值，在相同10 mL的运输培养基础中，加入相同的10μL的丙型肝炎病毒样本，并在相同的条件下进行25 ℃环境下模拟运输培养工作，培养48 小时，通过荧光定量PCR检测（为方便结果比较，将检测结果同等比例换算回原样本未稀释前的比例），比较不同pH值下对病毒稳定的影响结果（如图1）。
.png)
Figure 1 The influence of different pH values on virus stability
通过图1结果显示，培养基pH值在7.1-7.4之间时病毒存活最稳定，pH值在6.8下以随着pH值的降低，对病毒活性抑制明显，而在8.0以上时随着pH值的升高会有一定的抑制作用，而在8.0-8.9之间会对于病毒的活性有一定的抑制作用相对缓慢，8.9以上抑制明显。
2.2运输培养基中添加不同保护剂对病毒稳定性的影响
在Hank’s基础平衡盐基础上分别加入葡萄糖、蔗糖、海藻糖、BSA、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000甘油7 种类不同的病毒稳定保护剂，其浓度分别为0%，1%，5%，10%，15%，20%，25%的比例，在相同10 mL的运输培养基础中，加入相同的10 μL的丙型肝炎病毒样本，并在相同的条件下进行25 ℃环境下模拟运输培养工作，培养48 h，通过荧光定量PCR检测（为方便结果比较，将检测结果同等比例换算回原样本未稀释前的比例），比较不同浓度下不同保护剂对于病毒保存效果的影响（如图2）。
.png)
Figure 2 Verification results of different protective agents on virus survival stability
通过图2结果显示， BAS对于提高病毒存活有着显著的保护作用最显著，在一定浓度范围内随着浓度的增加而增强，液体培养基中BSA含量达到10%时，即可满足病毒保存稳定48 h时的效果，蔗糖也有一定的保护效果，其他保护剂保护效果不明显。
2.3非必需氨基酸的选择
在Hank’s基础培养液基础上分别添加不同浓度的谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸8种非必须氨基酸，在25 ℃室温下进行模拟运输48 h培养，观察不同氨基酸对病毒保存的影响效果，检测实验结果如图3。
.png)
Figure 3 The effect of different non-essential amino acids on virus activity
通过实验可知丝氨酸、胱氨酸以及谷氨酸对于病毒的稳定有一定效果，强度依次为丝氨酸＞胱氨酸＞谷氨酸。
2.4不同种类抑菌剂的选择探索
2.4.1选用生化试剂中常用的抗生素类和化学类抑菌剂，分别添加到相同体积的运输培养基中，验证不同浓度的抑菌剂对病毒生长的影响情况，所选用的不同的抑菌剂的种类如表1所示。
.png)
2.4.2将不同种类的抑菌剂放置于相同体积的运输培养基中，并接种相同数量的丙型肝炎病毒样本，放置于25 ℃室温环境下进行模拟运输培养48 h，最终计算病毒的存活比例，其检测结果如图4和图5。
.png)
Figure 4 The influence of common antibiotics on virus activity
通过添加不同浓度的生物抗生素类的抑菌剂和化学类的抑菌剂，不同抑菌剂的添加对病毒的活性均有一定程素的抑制，生物抗生素类的抑制能力要远弱于化学类抑制剂；以病毒活性抑制量的10%以内作为可接受范围，生物抗生素中硫酸庆大霉素、制霉菌素、多粘菌素氯霉素添加量在100 mg/L以下时病毒保存量均在90%以上, 两性霉素B添加量在80 mg以下时病毒保存量在90%以上，氯霉素和头孢菌素则已执行较强分别在20 mg/L和10 mg/L以下浓度时，病毒保存量在90%以上，随着浓度的升高对病毒有明显的抑制作用。
.png)
Figure 5 The effect of common chemical antibacterial agents on virus activity
而对于化学类抑菌剂PC-300、叠氮化钠、MIT等抑菌剂对病毒的抑制作用过于强而无法使用，而BND-10和PC-8020浓度在0.3 g/L和0.6 g/L的浓度以下能够将病毒保存在90%以上。
.png)
Note：
①The amount of antibacterial agent added：Gentamycin sulfate :100 mg/L, Nystatin :100 mg/L, Polymyxin :100 mg/L, ChlorampHenicol:100 mg/L, Amphotericin B : 80 mg/L, Chloramphenicol :20 mg/L, Cephalosporins : 10 mg/L, BND-10: 0.3 g/L, PC-8020: 0.6 g/L.
② “＋”Represents the growth or color change of bacteria in the medium，“-” That means the medium has not changed.
3.4.3 根据上述实验结果，对病毒的存活率在90%以上的抑菌剂种类和数量，配置成运输培养基分别建立12组不同抑菌剂（如表2），分别在12组培养基中添加100 CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和白色念珠菌,在25℃环境下培养15天，每天观察每组培养基中菌种生长的情况，并进行结果记录，图6为培养15天后的不同培养基的情况。
.png)
Figure 6 Growth of strains in 12 groups of different media
通过实验比较第7-10组培养基未发生颜色变化（颜色保持原有的红色），同时也培养基澄清没有微生物的生长，而其他组中则发生了明显的颜色变化或发生了菌体的生长，因此单一或两种抗生素均达不到良好的抑菌效果，而化学抑菌剂由于使用量较少同样达不到良好的效果，只有四种抗生素联合使用效果最佳。
2.4.4对7-10组中的培养基再一次进行抗生素对病毒抑菌效果的验证，经过验证结果如图7。
.png)
Figure 7 The proportion of the number of viable viruses in the medium of the 7-10 group
通过图7中数据可知，四种抗生素类抑菌剂联合使用虽然在抑菌效果上有明显的提升，但是同时对病毒的抑制作用也有不同程度的增加，其中硫酸庆大霉素+多粘菌素+头孢菌素+两性霉素B组合存活率最高能够达到93.2%，满足运输培养基培养条件需求。
3 讨论与结论
病毒运输培养基是为了营造一个病毒在转运过程中维系病毒自身存活的环境，因此病毒运输培养基需要解决的问题主要有两个[14-16]：一方面是保证病毒在运输过程中存活且不受抑制，两一方面是运输培养基本身的稳定性，活体病毒的增殖一般采用鸡胚接种的方式进行培养，而本病毒运输培养基则建立在Hank，s平衡盐溶液基础上，首先建立最适的pH值环境，大多数病毒存活的pH范围在6-8之间，例如新型冠状病毒的最适pH值是7.3，这与本文探索的最适pH范围是7.1-7.4之间范围相符，有类似的病毒运输培养基将pH值调整到8.8-9.0之间，较高的pH可能对抑制细菌和真菌的生长有一定作用，但是同样也会抑制病毒的存活，因此不推荐使用。
病毒存活需要营养成分的补充，选用牛血清白蛋白作为稳定剂，牛血清白蛋白一方面可以为病毒存活提供营养，另一方面还可以保护病毒外壳蛋白不发生变性，从而提高病毒的稳定性，实验还发现适当增加蔗糖可以提高病毒的稳定性，主要因为大分子糖类物质对病毒蛋白外科结构有一定的保护作用，另外还选择丝氨酸和胱氨酸两种非必须氨基酸作为病毒存活的营养补充。
在临床使用过程中病毒培养基需要在常温下进行操作使用，商业化产品一般需要室温保存时间至少1年，因此对于培养基的稳定性要求就非常高，目前国内已经有类似产品推出，但是多数非灭活的运输培养基容易出现滋生细菌的情况，运输培养基中添加了pH值指示剂苯酚；苯酚为酸碱指示剂，变色区域pH值6.6（黄）～8.0（红），在pH值7.2～8.0时呈红色，在pH值8.0以上时呈紫色，当培养基自身发生微生物的滋生则会释放出二氧化碳导致颜色由红色变为黄色，而当培养基本身物质发生呈现碱性时则变为紫色，对于使用者识别培养基本身的好坏有重要作用。而对于保证运输培养基的无菌[17]，则首先保证灌装或者生产设备的无菌，一般在十万级洁净环境下在百级洁净台中进行分装，试剂在分装前进行使用0.22μm的过滤除菌，使用的容器均进行灭菌，但是实际情况下依然无法保证完全的无菌，为了提高产品的灭菌或抑菌效果，可选择的方法有辐照灭菌[18]和试剂中增加抑菌剂，成品的辐照灭菌低剂量达不到灭菌效果，高剂量则会让试剂变色或让试剂成分发生变化，且成本较高，也无法实现当日灭菌，因此存在种种弊端，另外一种方法则是从试剂自身入手，本文则重点从该方面入手，在试剂中添加抑菌剂，抑菌剂的加入需要保证既能有效抑制微生物又不能抑制病毒而的活性，大部分的抗生物对细菌和真菌有良好的抑菌效果，但是不同的抑菌剂同样对病毒会有一定的抑制作用，实验证明单一的抗生素效果并不理想，选用硫酸庆大霉素+多粘菌素+头孢菌素+制霉菌素的组合能够达到预期的目，但是对于生物抗生素抑菌剂的添加，也只能在一定微生物数量基础上起到较好的抑菌效果，因此作为批量商业化的产品，在产品中选择有效抑菌剂的同时，还应该严格控制生产环节中微生物的指标，从而提高产品的质量。
REFERENCE
[1] Yang TL, Xia AM, Hu XJ, Yu GZ, Shi H, Gu Y, Zhang XB, Wang CZ, Zhang CF, Huang GY. Specifications for the collection, storage and transportation of respiratory specimens[J] . Chinese Journal of Evidence-Based Pediatrics, 2020, (1): 19-21 (in Chinese)
杨童玲, ?夏爱梅, 胡晓静, 余艮珍, 史欢, 顾莺?, 张晓波, 王传清, 张崇凡, 黄国英. 呼吸道标本的采集、储存和运送规范[J].中国循证儿科杂志, 2020 (1): 19-21.
[2] Bao L, Mi YY, Zhu LQ, Hang HY, Zheng LP, Zhang YH, Su G, Wang YY, Cai ZY, Zhuang N, et al. Inerpretation of experts consensus on specimen collection technical in patients with coronavirus disease[J]. Chinese Clinical Nursing 2020, 12（3）: 185-189. (in Chinese)
包磊, 米元元, 朱丽群, 黄海燕, 郑兰平, 张艳红, 顾苏, 王营营, 蔡喆燚, 庄若等.《新型冠状病毒患者标本采集技术专家共识》解读[J]. 中国临床护理2020, 12（3）: 185-189.
[3] Shi QY, Zhang L, Liang SY, Huang LZ .Application value of nasal and oropHaryngeal swabs in COVID-19[J]. Chinese Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, 2020, 27（6）: 297-300. (in Chinese)
施清圆, 张露, 梁珊燕, 黄立真. 鼻腔口咽拭子在新型冠状病毒肺炎中的应用价值[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2020, 27（6）: 297-300.
[4] Hindiyeh M, Acevedo V, Carroll KC. Comparison of three transport systems(starplex starswab Ⅱ, the new Copan vipakamies agargel collection and transport swabs, and bblPort-a-Cu l) for maintenance of anaerobic and fastidious aerobic organisms[ J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(1): 377-380.
[5] Liao K, Chen DM, Luo L , Xuan JM, Zeng Y, Chen QG. Ability of Maintaining Bacteria Activity :Comparison Between Copan Transport Systems and Sterile Cotton Transport Systems[J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2005, 15（10）: 1147-1149. (in Chinese)
廖康, 陈冬梅, 罗兰, 禤建美, 曾燕, 陈求刚. Copan 运送系统与无菌棉拭子运送系统维持细菌活性能力的比较[J]. 中华医院感染学杂志, 2005, 15（10）: 1147-1149.
[6] Li XY, Jin XH, Yang JM. Comparison of the Effects of Different Respiratory Tract Swab Preservation Solutions on Nucleic Acid Test Results[J] Han Shao Ji Bin ZaZhi 2020,（27）4 ：20-21.(in Chinese)
李晓燕, 靳秀红, 杨俊梅, 不同呼吸道拭子保存液对核酸检测结果的影响比较[J]. 罕少疾病杂, 2020, （27）4 : 20-21.
[7] Zhang JB, Zhang SF, Lian XH. Tissue and cell culture technology (3rd edition)（M）. Acta Anatomica Sinica, People's Medical Publishing House(PMPH). 2014,（6）: 854. (in Chinese)
章静波, 张世馥, 连小华, 组织和细胞培养技术（第3版）（M）. 人民卫生出版社出版, 2014,（6）:854.
[8] Wu AG, Ceng B, Wang CL, Hang MQ, Chen JN, Lai XP. Study on solubility and stability of magnolol in Hank's balanced salt solution, Journal of Guangdong PHarmaceutical University[J]. 2010（6）: 568-571. (in Chinese)
吴安国, 曾宝, 王春玲, 黄孟秋, 陈建南, 赖小平. 厚朴酚在Hank’s平衡盐溶液的溶解性和稳定性[J]. 广东药学院学报, 2010(6): 568-571.
[9] Yang ZF, Qin S, Wang YT, Zhao HS, Hang QD, Guan WD, Zhou R, Mo ZY. Improvement and evaluation of a virus delivery medium[J]. Chinese Journal of Microbiology and Immunology Chin J Microbiol Immunol, 2009（11）:1030. (in Chinese)
杨子峰, 秦笙, 王玉涛, 招穗珊, 黄群娣, 关文达, 周荣, 莫自耀. 一种病毒运送培养基的改良及其评价[J], 中华微生物学和免疫学杂志, 2009（11）: 1030.
[10] Wen XZ. Animal virus preservation method [continued] [J]. Gansu Animal and Veterinary Sciences. 1981(3): 57-58+60
文希震. 动物病毒保存法[续] [J], 《甘肃畜牧兽医》, 1981(3): 57-58+60 .
[11] Wang H, Li H. Improvement of Methods for Storing RNA of Animal Tissues[J]. Biotechnology Bulletin, 2010, 36（6）:152-155. (in Chinese)
王华, 李华. 保存动物组织内RNA的方法改进[J]. 生物技术通报, 2010, 36（6）:152-155.
[12] Liu HZ. Study on the stability of hepatitis C virus nucleic acid in plasma under different storage conditions [J]. Chin J School Doctor, 2015, 29（11）: 859-860. (in Chinese)
刘洪正. 血浆中丙型肝炎病毒核酸在不同保存条件下的稳定性研究[J]. 中国校医, 2015, 29（11）: 859-860.
[13] Hang ST, Yang RJ, Lv L. Effect of maintenance medium components on the propagation efficiency of influenza virus[J]. Chinese Journal of Public Health Management.?2018, 34（5）: 613-616. (in Chinese)
黄世腾, 杨瑞军, 吕磊. 维持培养基组分对流感病毒增殖效果的影响[J]. 中国公共卫生管理, 2018, 34（5）: 613-616.
[14] Maynard ND, Gutschow MV, Birch EW, et al. The virus as metabolic engineer[J]. Biotechnology Journal, 2010, 5(7) : 686－694.
[15] Xia Y, Xu YG, Han WN, Ya XR. Study on the stability of hepatitis C virus nucleic acid in plasma under different storage conditions [J]. Journal of Medical Pest Control, 2010,26(5): 479-480. (in Chinese)
夏瑜, 许元根, 韩卫宁, 雅雪蓉. 流感病毒培养的影响因素[J], 医学动物防制, 2010, 26(5): 479-480.
[16] Sun Y, Zhang XL, Chen J, Liu P, Ma C, Zhang SY, Li W. Development of a procedure for preparation of rabies virus by culture of Vero cells in serum-free medium [J]. Chinese Journal of Biologicals, 2016（10）: 1099-1103. (in Chinese)
孙燕, 张香玲, 陈军, 刘鹏, 马超, 张生琰, 李薇. 无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立[J]. 中国生物制品学杂志, 2016（10）: 1099-1103.
[17] Zhou X, Wu WL, Hu LH. Effect of different culture medium in isolating influenza virus and exploration of the most ideal culture conditions [J]. Chinese Journal of Health Laboratory, 2018（8）: 941-944. (in Chinese)
周霞, 吴万里, 胡澜怀, 不同培养基分离流感病毒效果及最佳培养条件[J]. 中国卫生检验杂志, 2018（8）: 941-944.
[18] Chen WS, Pan W, Zhu XY. Comparison of different doses setting methods of radiation sterilization[J]. Drug Standards of China, 2019（6）：500-504. (in Chinese)
陈伟盛, 潘雯, 朱晓燕. 辐射灭菌不同剂量设定方法的比较[J], 中国药品标准, 2019（6）:500-504.
单位名称：齐鲁工业大学
纳税人识别号：1237000049557147XT
单位地址：山东省济南市长清区大学路3501号
开户银行：建行济南玉函支行
银行账号：37001616359050023231
刘新利，联系方式：18660773985，单位：齐鲁工业大学；地址：济南市长清区大学路3501号 850元发票