张润初
大连英领国际学校空港校区 辽宁大连 116021
癌症细胞实际是一类基因突变细胞的集合体，依据临床的基本诊疗方案，癌细胞几乎不能彻底根除。因而迫切需要对癌细胞进行分子分型和精准靶向杀灭指定基因突变的癌细胞。
本文以肺癌为例，重点探讨肺癌细胞的基因热点突变，通过热点突变寻找靶向治疗的方案，依据基因的二代测序技术针对病人手术后原发病灶进行序列捕获和分析，以期建立精准的靶向治疗方案。进一步，本文探讨了液体活检技术与二代基因深度技术的结合，以抽取病人手术前后的血液样本为基础，重点分析循环肿瘤DNA在血液中的存在情况，为癌症的疗效评估与复发监测提供基本的理论支撑。本文重点阐述二代基因测序技术的基因原理，包括杂交捕获，桥式PCR等系列技术，为肿瘤治疗提供新的思路。
随着二代基因测序为基础建立的基因大数据库的不断丰富，人类打开了认识癌症的发生、发展的自然规律的大门，为肿瘤和癌症病人的个体化诊疗方案提供新思路和新的突破。
关键词：肺癌基因突变，二代基因测序，循环肿瘤DNA，疗效评估，复发监测
1.癌症的病因
1.1癌症是什么？
癌症是指于上皮组织发起的恶性肿瘤，是多个细胞发生不同类型的基因突变的集合体。癌症分为不同的类型，40%为腺癌，25%到30%为鳞癌，10%到15%是大细胞癌，10%到15%是小细胞癌。癌症也有不同的阶段，分1到5期，其中2，3，4期又分AB这样的阶段。判断癌症分期的标准分为：肿瘤大小，囊膜完整度，淋巴结转移和远端转移。一期为小型肿瘤，二期为肿瘤最大直径大于4cm小于5cm时。而当出现淋巴结转移或者是囊膜转移即为2B期，当出现远端转移时上升到3期。
1.2为什么癌症久治不愈？
肺癌是死亡率最高的几种癌症之一。近五十年来男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。那么为什么肺癌的分布率如此之广而以如今的科学技术依旧不能完全治愈呢？首先我们需要了解什么是癌症。肺癌之所以无法治疗一是由于癌细胞是多种基因突变的集合体，每种基因突变都需要特定的药物靶向治疗，而癌细胞还可以产生耐药性，且癌细胞突变的消耗大量的时间和精力研究治疗方案。
1.3肺癌的特定药物
肺癌一般分为小细胞癌和非小细胞癌。小细胞癌一般无法治疗，只能通过不断的手术，化疗和放疗进行治疗。而非小细胞癌中的大细胞癌和鳞癌也极难治疗，都只能通过和小细胞癌一样的治疗手段治愈，其中大细胞癌由于特点不明显更加难以治疗，而鳞癌由于比较常见，所以治疗效果也要稍好一些。腺癌则可以通过特定的靶向药物对热点突变进行靶向治疗。
热点突变为突变概率较高的碱基。而肺癌的热点突变一般为EGFR、ALK、MET、RET、KRAS、BRAF、NTRK、Her-2、ROS1、FGFR等类型的基因突变，每种突变有其对应的靶向药物治疗。
2.癌症的测序手段
2.1液体活检技术
一般我们会采用液体活检技术来监测癌症患者的治疗效果与复发几率。CTC（circulating tumor cell）指脱落的肿瘤细胞经过淋巴结或血液循环进入人体循环系统的肿瘤细胞。活的癌细胞会释放出一些循环肿瘤细胞，而坏死的癌细胞则会释放出一些循环肿瘤DNA（ctDNA）到血液中。血浆中本来就会存在一些游离的DNA分子，我们一般称为血浆游离DNA（cfDNA）而癌症患者的cfDNA会增多。液体活检技术就是通过测量血液中各类DNA的含量来进行对病人治疗效果的评估。
2.2 PCR技术
PCR技术是基于人类的DNA复制形成的技术。
DNA的复制分为体内复制和体外复制，体内复制首先时在一段DNA处由DNA解旋酶负责将DNA双链解旋，由于DNA的合成总是从5’端到3’端，所以DNA的5’到3’链是通过半保留复制形成，而另一条链是通过半不连续复制形成的。
由于半不连续复制后随链上DNA是断开的，分成各个片段(冈崎片段）所以后续的DNA聚合酶会向3’方向滑动，补齐单链。
DNA的体外复制就利用了DNA聚合酶的特点，也就是PCR技术，实验材料为一段DNA模板，一段引物（人为设计的RNA），DNA聚合酶和缓冲液，首先加热至98℃破坏氢键（变性），形成DNA单链，模拟体内解旋，加入引物再进行降温（退火）。DNA双链在降温是会重新形成分子间作用力，所以人们选择55℃让双链重新结合，在缓冲液中的引物会被吸引到无碱基的DNA链上。在局部区域形成双链，有利于DNA聚合酶的结合。最后升温至72℃让DNA聚合酶工作，形成互补链。
同时DNA的体外复制还可以通过设计并导入所有的碱基来进行，但由于成本过高，所以无特殊情况的时候不会使用该方法。
2.3 NGS测序
NGS测序是基于PCR技术与sanger第一代测序的高通量测序1（二代测序）。它可以通过检测人类DNA中的碱基序列，从而判断发生了什么种类的基因突变，来订下治疗方案。是检测癌症基因突变的主要方法。
二代测序的流程分为，提取需要的患者肿瘤部分的组织块，放入液体内进行超声波破碎，将基因组片段化，再进行建库，最后通过二代基因测序的结果进行分析。
而建库的方法是基于捕获技术（靶向捕获，杂交捕获等），是通过将散乱的DNA加上相同的接头，然后利用探针杂交的技术进行捕获。探针即是一段人为设计的DNA单链，与PCR技术的引物类似。
下一步是对感兴趣基因的放大，以便我们进行深度测序。通过桥式扩增的方法，杂交捕获后形成的感兴趣DNA的接头会被附近互补的接头吸引，互相连接，形成桥状的DNA，接着周围游离的DNA会继续与这段感兴趣DNA进行碱基互补，再形成互补前的DNA，而这些DNA还会被游离的DNA继续进行互补，每次互补的时候感兴趣DNA的数量都会翻倍。最后在固体上会形成一些簇状的DNA，将互补链或是模板链的一种切断，通过在核苷酸的高能磷酸基团处加上荧光基团，并且分别对应四种碱基，通过水解高能磷酸键再用激光照射进行发光，来判断DNA的序列信息。然后拍照放入机器进行测序。最后得出结论，确认患者的突变类型。
2.4 基因编辑
基因编辑作为近些年来遗传学研究的热点，科学家们认为基因编辑同样可以治疗癌症或者type-1糖尿病这类基因突变型的难以攻克的疾病。
基因编辑属于人工进行的基因变异，包括对碱基的插入，缺失，增添和倒位等。通过定向或非定向的同源重组引入若干碱基来对基因改造。其中的定向基因编辑是由?CRISPR-Cas系统为中心。
CRISPR-Cas系统是原核生物的一种自带的免疫系统2。一些古细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段切割后存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的基因区。当病毒再次入侵时，这类古细菌能够根据储存的基因片段识别病毒，将病毒导入到细菌体内的DNA链切断。
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CRISPR-Cas9可以被导入到病人的DNA突变处，对靶向基因进行剪切，使DNA双链解旋。在人体内DNA双链被外界因素干扰而解旋时，细胞会采用非同源末端连接修复断裂的DNA。但是，在修复过程中通常会发生碱基的错配现象，由于插入或者倒位等类似于基因突变现象的发生，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此设计两条sgRNA的碱基序列来断裂DNA双链，分别靶向DNA互补的两条链这样在修复的过程中就可以实现成功的基因敲除。
结语
希望在不久的将来，人类能够攻克类似于癌症类型的由多基因突变引起的疾病，让人类拥有更好的生存环境与生存空间。也希望在不久的将来人们可以发现新的物质让基因编辑成为一种实用性强且速度快的医学治疗方案。等到未来人类成功了解所有遗传密码的含义后可以对人类进行随意定向的基因编辑，让对自己基因不满或得了基因遗传或基因突变疾病的人们拥有改变自己命运的机会3。
《参考文献》
[1]刘刚, 彭惠茹, 倪中福, 秦丹丹, 宋方威, 宋广树, 孙其信.遗传与基因表达数据的整合—— eQTL 的方法及应用.2008,04: 1229
[2]高鸿烨, 冉取丙, 胡昕, 朱强.CRISPR/Cas介导的非转基因植物基因组编辑.2021,04: 2
[3]陈龙.人类基因编辑技术的立法价值和程序要求. 2021,04: 120