梁慧娟，赵文娟，张蒙，徐素华
仁合熙德隆药业有限公司，河南 郑州 451450
【摘要】目的：建立去甲斑蝥素片的微生物限度检查方法。方法：依据《中国药典》2020年版四部通则1105、1106、1107进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌检查方法适用性试验研究。结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数采用平皿法，计数方法适用性试验回收比值均在0.5～2.0；控制菌检查采用直接接种法,有菌生长，且菌落大小、形态特征、指示反应与大肠埃希菌相符。结论：所建立的微生物限度检查方法能充分检出去甲斑蝥素片中的微生物，保证该检查方法用于该药品的科学性、可行性。
【关键字】去甲斑蝥素片；微生物限度检查；控制菌检查；回收比值
中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：
微生物限度检查法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等，是检验产品质量的重要手段，日常使用微生物限度检查前，应进行微生物计数方法和控制菌检查方法适用性确认，以确保所建立的方法可用该供试品的检查。去甲斑蝥素片执行标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准Ws-10001-（HD-0036）-2002，该标准没有对微生物限度检查方法进行明确规定，故参照《中国药典》2020年版对去甲斑蝥素片的微生物限度检查方法适用性进行研究，建立合适的微生物限度标准和检查方法，保证检验结果的正确性。
1 材料与方法
1.1设备、试剂与菌种
设备：SHP-250型生化培养箱（上海精宏）；MJP-250型霉菌培养箱（上海精宏）；DNP-9162型电热恒温培养箱（上海精宏）；BHC-1000ⅡA2型生物安全柜；SW-CJ-2FD型洁净工作台（苏净安泰）；ME203/02型电子天平（梅特勒）；FE20型pH计（梅特勒）。
样品：去甲斑蝥素片（仁合熙德隆药业有限公司，批号为DMC1191101、DMC1191102、DMC1191103，规格为每片5mg）。
试剂：胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基、沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基、胰酪大豆胨液体（TSB）培养基、沙氏葡萄糖液体（SDB）培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基，均源于北京三药科技开发公司，试验前，均已进行培养基适用性检查，且符合《中国药典》2020年版四部通则要求；pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液等按《中国药典》2020年版配制和灭菌。
菌种：大肠埃希菌（Escherichia coli）﹝CMCC(B)44 102﹞、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）﹝CMCC(B)26 003﹞、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）﹝CMCC(B)10 104﹞、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）﹝CMCC(B)63 501﹞、白色念珠菌（Candida albcans）﹝CMCC(F)98 001﹞、黑曲霉（Aspergillus niger）﹝CMCC(F)98 003﹞，均来自中国医药细菌保藏管理中心，工作用菌种为新制的第三代、第四代菌液。
1.2方法
1.2.1供试液制备
取样品10g，精密称定，加入100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，45℃恒温振摇，混匀，制成1:10供试液。
1.2.2计数方法适用性试验
1.2.2.1 菌悬液制备
新鲜制备的工作用菌液，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌使用0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释成适宜浓度，黑曲霉使用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释成适宜浓度。
1.2.2.2 试验分组
试验组：取5个无菌试管，每管加入1.2.1项1:10供试品溶液9.9ml，然后分别接种0.1ml五种试验菌菌悬液（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉），每1ml菌悬液含菌量不大于104cfu，混合均匀，取1ml置于直径为90mm无菌平皿中，注入约20ml不超过45℃熔化的TSA培养基或SDA培养基，混匀，凝固，按规定条件倒置培养，计数。接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的TSA培养基于30～35℃不超过3天；接种白色念珠菌、黑曲霉的TSA培养基于30～35℃不超过5天；接种白色念珠菌、黑曲霉的SDA培养基于20～25℃不超过5天。
供试品组：取1.2.1项下1:10供试液1ml置于直径为90mm无菌平皿中，注入约20ml不超过45℃熔化的TSA培养基或SDA培养基，混匀，凝固，按规定条件倒置培养，计数。注入TSA培养基的平皿于30～35℃培养3～5天；注入SDA培养基的平皿于20～25℃培养5～7天。
阳性对照组：取1ml菌悬液（含菌量不超过100cfu/ml）注入直径为90mm无菌平皿中，其余操作为试验组。
阴性对照组：取1mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液注入直径为90mm无菌平皿中，其余操作为供试品组。
1.2.2.3 判断标准
试验菌组的回收比值应在0.5～2.0。
试验菌组的回收比值=
1.2.3 控制菌检查方法适用性试验
1.2.3.1试验分组
试验组：增菌阶段：取1:10供试液10ml和1ml大肠埃希菌菌悬液（含菌量不大于100cfu）直接接种于100mlTSB培养基中，混合均匀，置于30～35℃条件下培养18～24小时。选择和分离培养：取增菌阶段培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，置于42～44℃条件下培养24～48小时。去麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，置于30～35℃条件下培养18～72小时。
供试品组：取1:10供试液10ml直接接种于100mlTSB培养基中，其余操作同试验组。
阳性对照组：取1ml大肠埃希菌菌悬液（含菌量不大于100cfu）直接接种于100mlTSB培养基中，其余操作同试验组。
阴性对照组：取10mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液直接接种于100mlTSB培养基中，其余操作同试验组。
1.2.3.2结果判断标准
试验组和阳性对照组有大肠埃希菌生长，增菌和选择培养阶段均有菌生长，分离培养阶段有菌生长，菌落形态为鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润；阴性对照组和供试品组无大肠埃希菌生长。若供试品组在麦康凯琼脂平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。
2结果
2.1计数方法适用性
结果汇总为表1。各试验菌的回收比值均在0.5～2.0之间，符合《中国药典》2020年版的要求，即需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数方法采用平皿法（1:10供试液）能有效去除抑制作用，可以保证检验结果的准确性。
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2.2控制菌检查方法适用性
结果汇总为表2。采用1:10供试液10ml直接接种于100mlTSB培养基中，试验组和阳性对照组均生长良好，阴性对照无菌生长，菌落形态、指示特征与大肠埃希菌的一致，显微镜下观察结果为革兰氏阴性，短粗杆菌，无芽孢，镜检结果与大肠埃希菌的一致，因此该方法有效去除了供试液的抑菌性，可采用该方法进行控制菌（大肠埃希菌）检查。
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3结果分析
去甲斑蝥素片为常用抗肿瘤药的一种，其有效成分为去甲斑蝥素，在未进行方法学验证的前提下，很难判断抑菌性的强弱，但考虑去甲斑蝥素含量为5mg，优先考虑常规检验方法-平皿法进行微生物限度检查方法适用性，从试验结果可知，采用平皿法（1:10供试液取1ml）和直接接种法（1:10供试液10ml接种100mlTSB培养基中）进行检验，无抑制作用或其抑制作用可忽略不计，上述方法为一种有效的微生物限度检查方法，可确保检查结果的准确性和可靠性。
参考文献
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