蒋学珍
云南省怒江州食品药品检验所673199
摘要：非无菌药品在生产、运输、储存等环节可能会引入微生物污染。微生物限度检查是非无菌药品质量标准检查项下内容，将是检查药品中微生物污染状况，保障用药安全性和有效性的重要方法。药品中很多组分都有抑菌作用，从而干扰检查结果的准确性，因此中国药典规定微生物限度检查所选方法的适用性必须要经过确认。方法适用性试验影响因素很多，其中标准菌株的保存、活化、使用、加菌回收是方法适用性试验的操作难点和关键点之一。
关键词：药品微生物 限度检查 存在的问题
引言
制药行业中涉及的微生物检验主要分为生产过程监控和出厂检验两部分。生产过程监控包括原辅料和中间产品的检验，制药用水的监控，微生物药物的发酵菌种等的鉴定分析，环境微生物的监控、调查和溯源；出厂检验包括终产品的无菌检查，非无菌产品的微生物限度检查，微生物菌株等的鉴定分析。微生物检测分析方法包括微生物的检测、筛选、计数和鉴定等。由于传统微生物检测方法简单有效且相对成本低，适用于大部分微生物检测实验室，同时这些方法也存在检验周期长和不能实时反馈工艺和产品现状等问题，成为生产过程微生物质量实时监控及快速放行的障碍，不完全适用于基于过程控制和风险评估的现代化制药行业管理模式。
一、检验方法
根据《中国药典》（2020版）[1101]以及相关药品检验要求，对药品进行微生物限度检验，检验内容包括需氧菌总数、霉菌，酵母菌数、控制菌检验，详细记录各种误差发生情况，同时分析影响检验结果误差的主要因素。在误差影响因素分析中，按照以下步骤进行分析：（1）确认一级影响因素指标，具体包括检验人员（“人”）、检验器具与设备（“机”）、检验材料（“样”）、检验方法（“法”）、检验所处的环境（“环”）；（2）确认二级影响因素指标，在一级指标的基础上进行细化二级指标，同时排除一些不可控因素，如空气质量、材料、实验室来源菌控制等。其中，“人”包括检验人员的质量控制意识和操作技能水平；“机”包括器皿、设备的洁净度以及设备的性能；“样”包括样品污染程度、活体易变性、抑菌成分、原材料含菌量、原菌液材料质量；“法”包括操作技术标准、材料控制标准、实验室环境质量控制标准；“环”包括培养基质量控制、菌悬液的质量、验证用菌的传代次数、检验技术问题、稀释准确性、菌悬液培养时间控制、菌液保存质量。
二、方法适用性试验影响因素
由于药品的微生物检查可能会受 到药物抑菌活性成分的干扰，需通过方法适用性试 验对样品的具体检验方法( 添加中和剂、采用稀释 法和薄膜过滤法等) 进行确认，同一生产单位不同 品种或同一品种不同生产单位的药品微生物检查方法具有专属性。另外，菌种和菌液的制备是影响方法适用性结果的重要因素， 中国药典对标准菌株的保存、传代次数、活化、菌液制备和使 用均有详细规定。微生物标准菌株易变异，在保存和传代过 程中，应定期验证储备菌株的活性和纯度，以确认菌种的有效性。
方法适用性试验需使用新鲜培养物，除黑曲霉外， 梯度稀释至适宜浓度的菌悬液室温下保存 2 h，2 ～ 8℃ 条件 下也只能保存 24 h 。为了保证方法适用性试验结果的 准确性，对制备的菌液浓度也有严格规定，含菌供试液中菌 落数不大于 100 cfu·ml －1 ，菌株活化和菌液稀释过程对试验 人员工作经验和操作技术要求较高，是方法适用性试验操作 的难点和关键点。
三、药品生产过程微生物控制体系建设
灭菌工艺控制包括灭菌工艺的开发、验证和日常监控等内容。开发灭菌工艺时需要对微生物的种类、数目及其耐受性进行综合评估；验证时，需要通过选择适宜的生物指示剂，对以物理参数表征的微生物杀灭力(Fphysical)如温度、时间、压力等用生物指示剂测定的生物杀灭力(Fbiological)进行验证，确定日常灭菌参数的有效性；日常监控阶段，可根据实际情况选择性地对环境微生物的种类、数目及耐受性进行监控；在关键生产环节，应采取各种措施降低样品的生物负载(物品表面或内部所有的活微生物)，控制生物负载在规定的限度内；当发现环境微生物种类、耐受性出现较大变化或关键生产环节样品的生物负载超出规定限度时，应启动偏差调查(OOS)程序，消除污染源。不可接受微生物是指药品中已知有明显的致病性，有足够的数量，通过产品的给药途径可导致患者出现不可接受的风险，但在现行非无菌药品微生物限度标准中没有被作为特定控制菌进行控制的污染微生物。对非无菌药品中不可接受微生物的评估/检测是非无菌药品微生物过程控制的关键，药品被不可接受微生物的污染是FDA药品召回的主要原因之一。目前国内尚没有针对药品原辅料、水系统、中间产品、成品、环境中不可接受微生物进行评估/检测的指导原则。虽然由中国食品药品检定药检院牵头的药典标准提高课题，已经完成了对不可接受微生物——洋葱伯克霍尔德菌群检查法的相关研究，但根据原辅料及制剂的特性、制剂的用途和生产工艺等因素，建立评估/检测不可接受微生物的方法是另一项具有挑战性的工作。
四、药品微生物实验室建设
在药品微生物过程控制中，生产企业对药物微生物的污染控制负主体责任，推进药品微生物过程控制在生产企业的全面实施，企业微生物实验室的能力与管理水平是成败之关键。以湿热灭菌工艺的参数放行为例，虽然采用参数放行的产品无需对终产品进行检验，但在生产过程中需对多个关键质控点进行控制。良好的参数放行过程需要有与其生产工艺配套的标准；而持续的人员培训、专业的微生物及灭菌工艺专家以及良好的GMP环境是实现参数放行的基础。即药品生产过程中的无菌保障水平，与药品生产企业的微生物的水平直接相关。中国药典2020年版充分借鉴国外药典和监管的经验，通过对系列与过程控制相关的新标准/通则的增修订，如通则1421灭菌法、灭菌用生物指示剂指导原则和生物指示剂耐受性检查法指导原则等，促使企业在实施过程中重视微生物实验室的能力建设。
结束语
中国药品微生物污染控制体系的建设包括药品微生物实验室建设、药品微生物控制标准体系建设和中药微生物控制体系建设。中药微生物控制体系建设作为中药国际化的重要组成部分，已经取得了实质性的进展，提升业界对微生物污染风险的认识是关键。目前药品微生物控制标准体系建设的重点是全面推进微生物过程控制理念的实施，生产企业将成为药物微生物污染控制的主体，全面提升企业药品微生物实验室的能力与管理水平成为关键。
参考文献
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