国颖
北京市昌平区昌平水务局未来科学城再生水处理中心 北京市 102200
摘要：水是生命之源，随着生活水平的不断提高，人们的生活也从温饱走向小康，对生活品质和环境有了更高的追求，对水质环境，尤其是对作为饮用水水源的水质环境和饮用水安全也越来越重视。本文结合实际，从水质微生物检验样品不合格原因分析与解决对策，做到检测结果准确可信，可追溯。
关键词：水质监测；微生物；不合格原因
引言
在水质监测工作中，水中微生物的检验一直存在一些问题，比如对微生物的标准分析，如何寻找有效的参考样品，这些情况都必须要进行具体情况具体分析，因此对工作人员的工作经验有一定的要求，在检验工作中个人的经验判断显得比较重要。对于水质微生物的检验过程必须是从样品的采集以及到检验结果的分析，这些检验结果包括对样品采集技术以及检验人员和实验步骤等都有一定的影响作用。
1材料和方法
1.1样本来源
84件非饮用水样本采集于2019年8月—10月某区24家公共场所。样本包括集中空调冷凝水9件，冷却水55件，淋浴水20件。样品采集方法依据GB/T18204.5—2013。
1.2仪器与试剂
Quanti-trayplus程控定量封口机(IDEXX)，六联不锈钢微生物过滤系统(Sartorius)，罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR仪(罗氏公司)。
1．2．1试剂GVPC琼脂平板、BCYE琼脂平板、L－半胱氨酸缺失的BCYE琼脂平板，购于OXOID公司。嗜肺军团菌乳胶凝集试剂Lp－1型、Lp2－14型，购于OXOID公司。嗜肺军团菌生化鉴定试剂盒，购于环凯微生物。嗜肺军团菌核酸检测试剂盒，购于江苏硕世。Legiolert试剂、预处理试剂、Legiolert定量盘，购于IDEXX公司。
1.3方法
1.3.1酶底物法
(1)样本处理与培养根据Legiolert说明书进行。在无菌微管中加入1mLLegiolert预处理液及1mL样品，涡旋混匀后室温下温育1min，转移至100mL溶解的Legiolert试剂中，充分混合并倒入Legiolert定量盘，用SealerPlus程控定量封口机密封。将密封好的Legiolert定量盘纸侧向下置于(37±0.5)℃培养箱中，培养7d。7d后，定量盘中棕色孔或浑浊孔即为阳性孔。(2)阳性孔确证试验为了检验酶底物法的特异性，对Legiolert定量盘中阳性孔进行确证试验。Legiolert定量盘共有6个大孔，90个小孔。如果阳性孔数小于10个，全部进行确证;如果阳性孔数大于10个，先选取10个(包括全部大孔及随机选取的小孔)，再加上随机选取剩余阳性孔数的25%进行确证。确证方法为使用无菌注射器抽取10μL悬浮液，涂布BCYE和L－半胱氨酸缺失的BCYE，35～37℃培养48～72h，在BCYE上生长、L－半胱氨酸缺失的BCYE上无生长的菌落进行生化鉴定、血清型别鉴定及real-timePCR鉴定。(3)酶底物法的计量结果酶底物法采用MPN法确定样本中嗜肺军团菌含量，计算阳性大孔和小孔的数目，并从LegiolertMPN表获得所得的MPN值。MPN是应用概率理论来估算细菌浓度，实际菌落数有可能落在置信区间内的任何一点，MPN值是落在这个置信区间内概率最大的一点。
1.3.2过滤培养法
(1)过滤、洗脱、前处理依据GB/T18204.5—2013，使用六联不锈钢微生物过滤系统对非饮用水样本进行过滤处理。抽滤完成后，取下滤膜置于15mL灭菌水中充分洗脱，洗脱液在培养前进行酸处理与热处理。
(2)接种与培养
取酸处理样品、热处理样品各0.1mL接种GVPC。于35～37℃、2.5%CO2环境中培养10d。24h内长出的为非嗜肺军团菌，24h后长出的为可疑嗜肺军团菌，继续鉴定。
(3)菌落验证
选取可疑菌落，如果数量小于10个则全部选取;如多于10个，则选取10个及超过10个数量的25%。
将选取菌落接种BCYE和L－半胱氨酸缺失的BCYE，35～37℃培养48h，在BCYE上生长、L－半胱氨酸缺失的BCYE上无生长的菌落继续进行生化鉴定、血清型别鉴定及real-timePCR鉴定。
(4)结果判定
定性结果:酸处理与热处理后的培养结果，只要有一种方法培养出嗜肺军团菌，即判断该样本含有嗜肺军团菌。定量结果:酸处理与热处理后的培养结果，选取菌落数量较大值为该样本定量结果。
2试验结果
通过分析水质样品的检验结果，可以发现84份标本试验样品，其中由于水资源本身质量问题造成的样品检测结果不合格的比例为17.59%；由于采样方法错误及检测程序不规范等造成的样品检测结果不合格的比例为74.99%。也就是说，造成水质微生物检测结果不合格的原因有多种形式，大体可以分为主观因素与客观因素两方面。同时，可以发现，样品本身质量问题以及实验室环境等客观因素造成样品检测结果不合格的比例较小，而由于采样方法错误与检测流程不规范等主观因素导致样品检测不合格的比例较大。因此，在水质微生物检验中，要想获取真实有效的实验结果，就必须注重水质微生物检验样品采集以及相关检验流程顺序的规范化操作。
3相关试验讨论
当前，微生物技术的整体发展趋于成熟，进一步加快了我国微生物检验技术的应用发展。借助水质微生物检验技术，可以综合评估判断生活饮用水的具体水质状况，预先了解该区域水质的污染程度和可能的污染发展趋势，在很大程度上可以确保生活饮用水的安全性，保障居民的身体健康。因此，通过探究水质微生物检验技术产生不合格结果的原因，继而提出相应的解决策略措施，对今后形成模式化的生活饮用水水质微生物检验、提供必要的规范化流程具有重要的指导意义。
3.1检测环境质量控制
3.1.1洁净室的环境质量控制
微生物实验室布局应合理，分区要清晰，要有准备室、洁净室、培养室，最大限度降低来回折返的概率，降低交叉污染等风险。洁净室的操作环境对微生物检测结果的影响很大，检测应遵循无菌操作，防止人员、环境对样品的污染以及样品间交叉污染。检验检测机构可以编写《微生物环境质量控制规定》等相关体系文件指导日常工作开展。广州开发区水质检测中心编写的体系文件《微生物环境质量控制规定》中对洁净室做了一系列环境控制规定：进入洁净室人员必须穿戴无菌操作专用衣帽鞋及口罩，每天对上述物品进行紫外灯照射，每周消毒水浸泡清洗；洁净室每天检测前要开启紫外灯照射灭菌30分钟，并开启空气净化系统1小时以上，每周用“84消毒液”擦拭工作台、其他器皿、灯管、门窗和地板，最后开启空气净化系统1~2小时候后，在无人状态下开启紫外灯10分钟进行灭菌；每月用生长有200~250个细菌菌落的琼脂培养皿暴露于紫外灯下2分钟，99%的菌落被杀灭，否则，应更换紫外灯；每月检测沉降菌，根据结果判定洁净室环境内的活微生物数，并以此来评估洁净室的洁净度。
3.1.2仪器设备表面灭菌效果质量控制
对于无菌室中的工作台、墙壁、摆放的各种物件及培养箱、冰箱内壁的表面灭菌效果要做监测，频率可以每月一次，检测其是否受到污染。
3.2检测内外部质量控制
每批微生物样品必须包含有空白样品、运输空白样品、平行样品的检测，以便排查出现可疑结果时的原因。检验检测机构应制定微生物的质量控制计划，内部质量控制可采用人员比对、方法比对、购买菌株质控样品考核、人员监督等手段，外部质量控制可采用参加权威机构组织的能力验证或实验室间比对等手段。为保证检测结果的准确可靠，可以多途径多手段进行质量控制。
结束语
总而言之，水质微生物的检验工作对饮用水的安全使用有很大的促进作用，而且对生态的平衡也有极为重要的作用。对此，相应检验工作人员应该对检测质量进行良好的控制，并且采用有效的质量控制方式，保证检验工作的全面开展，从而为我国饮用水的检验以及安全使用打下坚实的基础。而且对于具体地域的水质检测工作要采用具体性的检测方式，进行有针对性的检测。
参考文献
[1]马兵兵,王裔雄,侯文华,等.微生物检验标本不合格原因分析及质量控制对策[J].大家健康（中旬版）,2017,11(5):52.
[2]郭铮.微生物检验标本不合格原因及质量控制对策分析[J].食品安全导刊,2019(12):42.
[3]GB/T5750.12—2006生活饮用水标准检验方法微生物指标[S].