邓艳
西南科技大学 四川绵阳 621010
摘要：斑马鱼是一种重要的脊椎动物模式生物，因其胚体全透明，繁殖速度快，使用样品量少，饲养成本低，而被作为一种理想的模式动物广泛的应用于科学试验。本实验通过对斑马鱼生长条件研究，探究斑马鱼可以生长的适宜条件，并在一定条件下使斑马鱼产卵，探究斑马鱼孵化及鱼苗生长条件，建立斑马鱼的养殖平台，为之后进行斑马鱼毒性急性急性实验奠定良好的基础。
关键词：斑马鱼；生长发育；繁殖；胚胎发育孵化；鱼苗
斑马鱼（学名：Barchydanio rerio var，别名：蓝条鱼）是一种重要的低等脊椎动物模式生物，因其具有个体小、生殖周期短、繁殖能力强及胚胎透明便于观察等优点，被广泛应用于发育生物学、环境毒理学、免疫学等领域[1]。斑马鱼在基因水平上87%与人类同源，早期发育也与人类极为相似，这使得斑马鱼及其胚胎在人类疾病的研究中有重要的应用价值[2，3]。其胚胎、幼鱼和成鱼最早是被用来检测水中的有毒物质和致畸物[4]。
Streisinger 等[8]于 1981 年首次将斑马鱼与遗传学和生物学领域划上联系，使其研究领域得以拓展和延伸。目前，斑马鱼已被广泛用于遗传学、生态毒理学、药物药效活性物质筛选、药物代谢、药物毒性物质筛选等方面[9]。
该实验通过观察斑马鱼的形态特征，生活习性，繁殖发育，调节孵化条件，熟悉并建立斑马鱼养殖、繁殖、孵化、鱼苗养殖等一系列养殖平台，为之后开展斑马鱼相关生理药理实验奠定基础。
1 实验材料
1.1 实验用鱼
成年AB系斑马鱼，六月龄，来源于斑马鱼科研服务中心
1.2 仪器与设备
T-240F9L水族箱（宝潮水族专营店?）；产卵缸（南京一树梨花生物科技有限公司） 培养皿若干、斑马鱼饲料（斑马鱼科研服务中心）、控温棒（斑马鱼科研服务中心）、生化培养箱（上海坤天实验室仪器有限公司）、6孔板、电子分析天平（万分之一?赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.3 实验试剂
无水乙醇、500ml硝化细菌菌液、260ml水质稳定剂（上海寸景水族用品有限公司）、250ml胚胎培养液、亚甲基蓝（分析纯，成都市科龙化工试剂场
2 斑马鱼形态及习性
2.1外形及雌雄鱼分辨
AB型斑马鱼（野生型）体长为4～6cm，最大体长可达8cm。体呈纺锤形，稍侧扁。斑马鱼头稍尖，身上有斑马样的条纹。其背部为橄榄色，体侧从头至尾布满多条蓝色条纹，雄鱼为深蓝间柠檬色条纹，雌鱼为蓝色间银灰色条纹。公鱼的颜色比较鲜亮，母鱼的颜色则比较暗淡。雌鱼体型较雄鱼偏大，且雌鱼腹部较雄鱼有明显突出，在繁殖期，雌鱼腹部圆而突出，雄鱼腹部扁平。
2.2生活习性
斑马鱼性情温和，活泼好动，适宜混养。对水质要求不苛刻。养鱼用水水质: 每 1L 反渗透水中加入 200 mg 速溶海盐，电导作用为 480～510μS/cm；pH 为6.9～7.2；硬度为 53.7～71.6 mg/L CaCO3。喜在酸碱度中性的水中生活，喜新水，适宜水温22 ℃～30℃，极限低温为10 ℃。
3 斑马鱼的饲养繁殖
3.1斑马鱼饲养
6月龄野生型AB斑马鱼养殖于（28.0±1）℃的养鱼用水中，每9L水12条斑马鱼，雌鱼和雄鱼分开饲养。保证14h光照10h黑暗，27-28℃，给予充足的氧气，每天用斑马鱼饲料加丰年虾喂食2次，喂食完之后，需将鱼缸底部剩余饲料及鱼排泄粪便吸出，防止水质恶化。每三天换水1次，每次换水约1L左右，用自来水加水质稳定剂进行换水（10L水加1ml水质稳定剂）。每隔10天需添加硝化细菌菌液（10L水加1ml），沿缸壁缓缓加入，新缸计量翻倍，培养硝化细菌系统。
3.2 斑马鱼繁殖
食用丰年虾一段时间后，挑选适龄繁殖斑马鱼，控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14h∶10h[13]。将斑马鱼雄鱼与雌鱼分开，于晚上分别放入专用育种鱼缸中，用隔板将雌鱼与雄鱼隔开，为防止鱼跳出，需要用盖子盖住育种鱼缸，置鱼缸于28℃下，彼此适应过夜。次日早上去除挡板，引发排卵行为，可见雄鱼在鱼缸中追逐雌鱼时，雌鱼开始排卵，雄鱼也将精子排入水中，使卵受精，等待大约15～30min后，将亲鱼移出育种鱼缸，将水倒入滤网收集鱼卵，用过滤的鱼卵水将卵洗脱到培养皿中，每个培养皿50～100粒鱼卵，斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，平均每对成年斑马鱼一次能产两百左右胚胎。
4 斑马鱼胚胎的收集培养
收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基（2ppm亚甲基蓝，PTU）或胚胎培养液，使胚胎被培养液浸泡。置于28℃的恒温培养箱中培养，并将温度控制（28.5±0.5）℃，每天需要早晚各用含2ppm的亚甲基蓝溶液进行换水，观察并去除死胚胎，防止胚胎死亡和水酶产生。
5 孵化及育苗
鱼卵要用2ppm亚甲基蓝溶液处理，以防止水霉病等，孵化时间约为2-3天，在前两天可以用较大的气量，每天换水，但45h之后就要减小气量，孵化时温度控制在28℃左右。
刚孵化出来的斑马鱼鱼苗体型较小，体长不足5mm。斑马鱼可分为0-5天胚胎期，5-15天鱼苗开口期和15天-3个月幼鱼期。0-5天胚胎期，胚胎依靠自带的卵黄作为营养源生长发育，不需要投喂外源食物。5-15天鱼苗开口期。开口期的鱼苗喂养是斑马鱼养殖的关键时期，决定了斑马鱼的养殖成活率。胚胎孵化成鱼苗后，需要投喂饵料。开口期鱼苗体长约3.8毫米，可以吞食直径21-45微米的小颗粒饵料。一般投喂草履虫、轮虫或者鸡蛋黄粉末等开口饵料。同时，开口期鱼苗弱小，需要静水养殖。因此，需要每天人工更换新鲜的养殖水，避免水质恶化，造成斑马鱼鱼苗死亡。
6 问题及讨论
6.1产卵偶然性
在进行首次斑马鱼产卵工作时，将一条雌鱼与一条雄鱼放置于一起，成功产卵200-300枚，第二次同法进行产卵时，斑马鱼并没产卵，因此，斑马鱼产卵具有一定偶然性，可以一次多放置几组产卵缸进行产卵以排除偶然性。
6.2鱼苗发育死亡
鱼苗在可以自由游动并可以进食阶段最易发生水霉爆发，水中自由游动的水霉孢子会侵入伤口或卵膜，吸取皮肤及其组织内的营养而迅速生长，菌丝与伤口的组织细胞缠绕粘附，使组织发炎、坏死，当发生水霉时，初尝试采用胶头滴管吸取水霉，但效果并不大，过一两天后，水霉就会爆发，也尝试过转移鱼苗，但转移后鱼苗表面仍有霉孢子，不久之后仍会爆发，之后通过加入亚甲基蓝和生理盐水，测定其对水霉的抑制能力，发现2ppm的亚甲基蓝对水霉抑制作用最好，而且对鱼苗的伤害力弱。
参考文献：
[1]贾顺姬,孟安明.中国斑马鱼研究发展历程及现状[J].遗传,2012,34(09):1082-1088.
[2]方薇,曾静,王付利.模式生物斑马鱼在人类疾病研究中的应用[J].医学信息(中旬刊),2010,5(02):337-338.
[3]王晓伟,张红翠,安晓晶,王振华.新型模式生物斑马鱼及其胚胎在人类疾病模型研究中的应用[J].北方药学,2012,9(05):42-43.
[4]彭蕴茹,韦英杰,丁永芳,段金廒.基于斑马鱼模型的药物毒性研究进展与中药毒性研究新策略[J].中草药,2017,48(01):17-30.
[5]Streisinger G,Walker C,Dower N,Knauber D,Singer F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).[J]. Nature,1981,291(5813).
[6]Shelby L. Steele,Sergey V. Prykhozhij,Jason N. Berman. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases[J]. Translational Research,2014,163(2).
[7] 陈鑫,盛尚,江涛,刘智皓.急性光周期紊乱对斑马鱼繁殖行为的影响[J].重庆师范大学学报(自然科学版),2019,36(01):37-41.