张梅梅
哈尔滨市食品药品检验检测中心 150000
摘要：目的：建立了一种固相萃取-高效液相色谱法快速测定饮料中的碱性橙2（chrysoidineG，CDG）、碱性橙21（orangeG，AOG）和碱性橙22（astrazonorangeR，AOR）共3种禁用色素添加剂的方法。方法：样品采用C18-SPE小柱净化，洗脱液在35℃下用氮气吹至近干后用定容液溶解并定容，过有机相滤膜后在AgilentXDBC18色谱柱上，以20mmol·L-1的乙酸铵溶液和甲醇（体积比为35∶65）作为流动相进行分离，采用二极管阵列检测器（DAD）在449nm波长处检测CDG，在485nm波长处检测AOG及AOR，以外标峰面积法定量。结果3种碱性橙染料在0.50～20.0mg·L-1浓度范围内线性关系较好，方法回收率为86.8%～96.5%，相对标准偏差均小于2%（n=6），方法的检出限为0.01mg·kg-1。结论：本方法操作简便、快速、准确，可适用于美年达和芬达等橙色饮料中碱性橙的检测。
关键词：高效液相色谱法；固相萃取；碱性橙染料；饮料
引言
碱性橙染料是一类碱性工业染料，主要用于纺织品、木制品及皮革制品的染色，根据《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》的相关规定，碱性橙染料是禁止用作食品添加剂的化学制品。由于碱性橙染料比柠檬黄、日落黄等水溶性染料更易上色且不易褪色，因此一些不法商贩将碱性橙染料用于黄鱼、辣椒、饮料和腐竹等豆制品的染色，以次充好，严重危害消费者的身体健康。
食品中禁用的碱性橙染料主要有3种，包括碱性橙2（CDG）、碱性橙21（AOG）及碱性橙22（AOR）。目前主要有高效液相色谱法（HPLC）、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）[2]和超高效液相色谱-串联质谱法等检测方法。食品检测的国家标准主要是GB/T23496-2009《食品中禁用物质的检测碱性橙染料高效液相色谱法》，该方法中对于饮料等液体样品的前处理方法操作时间长、过程易损失，碱性橙染料回收率不好。本研究主要针对橙色饮料美年达、芬达和统一鲜橙多3种基质，采用固相萃取的前处理方法，用高效液相色谱法进行分离检测，建立一套简便、快速、准确的测定食品中碱性橙含量的方法。
1材料与方法
1.1材料
美年达和芬达等液体样品均购自本地超市和市场。
1.2仪器与试剂
甲醇、乙醇（色谱纯，上海安谱公司）；乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；标准品碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22（纯度＞88%，上海安谱公司）。所用试剂均为色谱纯，试验用水为一级水。Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；氮吹仪（美国ORGANOMATIONASSOCIATESINC.）；固相萃取仪（美国AgelaTechnologies）；涡旋混合器（德国IKA）；电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.3实验方法
1.3.1混合标准系列溶液的配制
①1000mg·L-1混合标准储备液。准确称取碱性橙2、碱性橙21和碱性橙22各约10mg（按纯度折算为100%），用甲醇溶解并定容至10mL。②100mg·L-1混合标准中间溶液。取混合标准储备液1.0mL，用定容液定容至10mL。③混合标准系列工作溶液。将混合标准中间溶液用定容液逐级稀释，配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg·L-1和20.0mg·L-1的混合标准系列工作液，现用现配。定容液为65%体积的甲醇和35%体积的0.02mol·L-1乙酸铵溶液的混合溶液。1.3.2仪器工作条件AgilentXDBC-18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：A：0.02mol·L-1乙酸铵溶液；B：甲醇；等梯度洗脱条件：A，35%；B，65%。流速：1.0mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：碱性橙2：449nm；碱性橙21、碱性橙22：485nm。进样量：20μL。检测器：二极管阵列检测器（DAD）。1.3.3试验方法将饮料样品混匀，称取10g（准确至0.01g）样品，过CleanertSC18-SPE固相萃取柱（2g/12mL），弃去流出液，最后抽干，再加10mL无水乙醇洗脱固相萃取柱，控制2滴/s的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，最后抽干小柱，在35℃下用氮气将洗脱液吹至近干，加入1.0mL定容液，涡旋30s溶解残留物，经0.22μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。按色谱峰的保留时间定性，以峰面积外标法定量。
2结果与分析
2.1洗脱液类型和体积的选择
分别采用10mL乙醇、10mL定容液、5mL乙醇+5mL定容液作为洗脱液，经过试验，发现由于定容液中有35%的水，所以10mL乙醇氮吹干得最快，5mL乙醇+5mL定容液次之，10mL定容液最慢，在液相上检测时用10mL乙醇作为洗脱液3种碱性橙回收率最高，故用10mL乙醇作为洗脱液。洗脱液乙醇体积分别为5、10、15mL和20mL时，试验结果见表1，结果表明，采用5mL乙醇洗脱回收率不高，10mL乙醇洗脱回收率较好，用15mL乙醇和20mL乙醇洗脱回收率与10mL乙醇差不多，但因氮吹时间太长，故选用10mL乙醇洗脱最佳。
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2.2氮吹温度的选择
分别选用20、30、35、40℃和50℃作为氮吹温度，经过试验，发现在20℃时氮吹时间较长，3种碱性橙回收率极不稳定，在40℃和50℃碱性橙2受温度的影响较大，在35℃时3种碱性橙回收率最高，试验结果见表2。故选用35℃作为氮吹温度。
表2氮吹温度对回收率的影响表
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2.3最终定容溶液类型的选择
分别用1.0mL甲醇和1.0mL定容液作为最终定容溶液，经过试验，用1.0mL定容液作为最终定容溶液，在液相中检测时3种碱性橙峰型较窄较好，峰高较高，用1.0mL甲醇时峰型较宽较差，故选用1.0mL定容液作为最终定容溶液。
2.4样品调PH值的选择
芬达橙味碳酸饮料PH值在4左右，用稀氨水调节PH值至7左右，进行试验，结果表明，样品pH值在4左右时3种碱性橙2、21、22的回收率分别为89.5%、96.2%、94.5%，pH值在7左右时碱性橙2、21、22的回收率分别为88.7%、73.3%、68.8%，故样品采用不调PH值直接检测。
2.5干扰试验
在色谱条件下，食品中常见的食用色素柠檬黄、日落黄、亮蓝、胭脂红、诱惑红和添加剂苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因在449、485nm处几乎无吸收，均不会干扰碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22的测定。
2.6线性关系及检出限
对碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22等3种碱性橙混合标准溶液系列进行测定，在0.5～20.0mg·L-1浓度范围内峰面积与溶液浓度之间呈一定的线性关系，以信噪比为3（S/N=3）计算检出限，结果见表3。
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2.7回收率实验
按照试验方法对基底浓度分别为0的美年达和芬达分别进行测定，同时做加标回收实验，结果见表4。
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3结论
本研究采用固相萃取-高效液相色谱法对美年达和芬达2种饮料样品测定违禁添加色素碱性橙的含量，3种碱性橙染料在0.5～20.0mg·L-1浓度范围内线性关系良好，方法回收率为86.8%～96.5%。该方法可适用于美年达和芬达等饮料样品中碱性橙染料的检测，同时具有操作过程简单、快速、稳定等优点。
参考文献
[1]戚美静，杨冀艳，朱昌磊，等.高效液相色谱法测定食品中的碱性橙染料[J].食品安全质量检测学报，2016，7（6）：2523-2528.
[2]刘艳霞，尹建波，苏?芳，等.反相高效液相色谱法测定碱性橙Ⅱ[J].化学工程与装备，2014（5）：165-166.
[3]李?娟，丁晓明，刘丹丹，等.高效液相色谱-串联质谱法同时检测辣椒制品中4种工业染料[J].河南农业科学，2014，43（5）：130-133.
[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T23496-2009食品中禁用物质的检测碱性橙染料高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2009.