殷小伟
苏州市相城环境监测站，苏州，215131
摘要：本文开发了一种用液相色谱质谱联用仪同步检测畜禽废水中5种磺胺类抗生素的方法。通过固相萃取富集提纯抗生素，通过梯度淋洗程序将5种磺胺类抗生素进行有效地分离。该方法具有较好的校准曲线线性、回收率、精密度，5种磺胺类抗生素的方法检出限在9~21 ng/L之间，具有较高的灵敏度。
关键词：液质联用、同步检测、畜禽废水、磺胺类抗生素
1、引言
在畜禽养殖业中抗生素被广泛地用于治疗动物疾病或作为促生长剂促进动物的生长。但是大多数抗生素都不能经过动物机体吸收或代谢而直接通过粪便和尿液直接排入环境中，导致抗生素的污染。近年来，在地表水、地下水、饮用水、污泥及土壤等多种环境介质中都检出了一定浓度的抗生素残留，虽然检出浓度不高，但是持续的暴露和多种抗生素的协同作用可能会对生态系统产生不利的影响。抗生素的长期存在会造成环境中敏感菌的耐药性增强，产生耐药菌，并在环境中扩展和演化，对生态环境及人类健康造成潜在危害。
磺胺类抗生素是畜禽养殖中较常用的一类抗生素，在畜禽废水和粪便中检出频率较高。本文开发了含高浓度有机物的畜禽废水中5种磺胺类抗生素的同步检测分析方法，利用固相萃取(SPE)和液相色谱质谱联用仪(LC-MS)进行分析。考察了校准曲线的线性、回收率、精密度和方法检出限，保证这种方法的适用性。
2实验部分
2. 1 药品、试剂及仪器
（1）试剂
磺胺噻唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑和磺胺二甲氧嘧啶均购自Sigma-Aldrich。乙腈和甲醇（色谱纯）购自Fisher公司，二氯甲烷（农残级）购自J.T. Baker。其他化学药品都购自北京试剂公司。
（2）分析仪器
实验中使用的仪器有：Waters液质连用仪（Alliance 2695/ZQ4000，Waters），分光光度计（HACH DR5000，USA），超纯水机（Millipore，France），离心机（博医康，中国）。
2.2分析方法
2.2.1 常规指标检测
实验中废水的pH 用pH计测定，化学需氧量用快速仪器法测定（HACH methods 8000, 620 nm检测）。
2.2.2 SMN检测的前处理方法
实验中的畜禽废水的pH 为 8.5±0.5， COD浓度为（5600±400）mg/L。为了保持微生物的活性，养猪废水采集之后马上加入1%的甲醇。样品在7000 r/min的条件下离心15分钟。上清液的pH用硫酸调节到2.5~3.0。然后上清液用0.45 μm的玻璃纤维滤膜进行过滤，之后储存在4 °C的冰箱里直到萃取。
固相萃取步骤如下：
（1）SPE柱依次用5 mL甲醇、5 mL 0.5 M的HCl溶液和5 mL去离子水活化后将200 mL水样以流速5 mL/min通过固相萃取柱；
（2）用5 mL 5%的甲醇溶液和5 mL去离子水淋洗后吹干，依次将SPE柱用3 mL正己烷淋洗，用10 mL的二氯甲烷和丙酮的混合液（3?2，v/v）淋洗收集于具塞比色管中并吹干；
（3）加入0.8 mL甲醇和1.2 mL去离子水定容至2 mL，以0.45 μm的水系滤膜过滤后进入LC-MS检测。
2.2.3 LC-MS检测
色谱柱为Waters Symmetry C18柱，柱长为150 mm，内径为2.1 mm，粒径5 μm，进样体积为20 μL，柱温为30 °C。流动相由3种流动相组合而成，流速为0.2 m L/min。流动相A为99.8%的水和0.2%的甲酸混合溶液。流动相B和C分别为甲醇和乙腈。利用梯度淋洗将5种磺胺类抗生素进行分离，梯度淋洗程序如下：第0 min时流动相比例A:B:C为90：4：6，保持10 min，第11 min时为90：0：10，第13 min时为87：0：13，第15 min为78：0：22，第25 min为55：0：45，第26 min为0：0：100，然后保持5 min，第33 min时为90：4：6然后保持12 min以便达到柱平衡。流动相比例每个梯度是线性改变的。5种磺胺类抗生素在28 min之内淋洗分离出来。
质谱仪为电喷雾离子源、单重四级杆，在正离子模式下操作。最优质谱条件：毛细管温度为120 °C，脱溶剂气温度为300 °C，毛细管电压为3.5 kV，脱溶剂气流速为300 L/h，选择离子记录模式（SIR）来定量抗生素。其他质谱参数见表1。
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抗生素的添加浓度：SML 8 μg/L; STZ、SMN、SMX 5 μg/L；SDM 0.5 μg/L
3、实验结果与讨论
3.1 校准曲线和线性
在纯水和养猪废水中混合添加5种不同浓度的磺胺类抗生素，从而建立标准校准曲线和基质匹配检量线。标准校准曲线和基质匹配检量线的所有的相关系数都接近0.99。结果表明基质匹配检量线能较好地定量畜禽废水中的5种磺胺类抗生素。
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3.2 回收率、精密度和方法检出限
参考基质中的抗生素背景浓度通过三组平行来测定。为了确定抗生素在参考基质中的回收率，总浓度应减去背景浓度。5种磺胺类抗生素在纯水和参考基质中的回收率都在70%~120%之间，相对标准偏差在1.7~13.7%之间。5种磺胺类抗生素的检出限在9~21 ng/L之间。
4 结论
本文开发了含高浓度有机物的畜禽废水中5种磺胺类抗生素的同步检测分析方法。通过固相萃取富集提纯，用LC-MS检测分析。每种抗生素的标准校准曲线和基质匹配检量线的所有相关系数都接近0.99。纯水和参考基质中的回收率都在70%~120%之间，相对标准偏差在1.7~13.7%之间。5种磺胺类抗生素的检出限在9~21 ng/L之间。结果表明该方法同步分析畜禽废水中的5种磺胺类抗生素是有效可行的。