刘杨 杜美娜 吴继周
新疆博尔塔拉蒙古自治州食品药品检验所 833403
摘要：药物筛选是药物开发过程中最重要的步骤之一。活细胞由于其生理和内部环境、微型化和高通量等特点，常被用作筛选工具。自21世纪以来,随着药物筛选技术的发展,精密医疗时代的到来,与传统的细胞培养相比,组更接近生理细胞和器官行为,基因组的稳定性,和适合生物转染和大规模筛选的优点,是最好的药物筛选模型。目前，液滴微流控系统可以实现高通量器官的可控加载和培养，降低其可变性。
引言
新药开发过程漫长、复杂且不确定，而高通量筛选是小分子药物设计中寻找起始化合物的策略之一。一般情况下，当对目标的研究较少时，首选高温超导。HTS靶点或细胞模型的选择取决于其与疾病的相关性、与其他靶点的相关性以及其创新性。筛选技术的选择取决于目标的可选性及其假定的化学变异性。不同的筛选技术适用于不同的靶材，对筛选技术的综述对后续高温超导的指导具有重要意义。
一、生化筛选体系
生化筛选是用纯化的靶蛋白在体外测定配体结合或酶活性的抑制。这些分析通常以竞争的方式进行，研究的化合物必须取代已知的配体或底物。384孔板通常用于检测，通常检测体积为20-50μL，用吸光度、荧光或发光等光学方法读取。摘要荧光分析法因其操作简单、灵敏度高、灵活性强等优点，在很大程度上取代了传统的放射性标记配体分析方法。常用的荧光检测方法如下：
1. 总荧光分析
孔的荧光值在固定时间内积分，如100 ms。常用于含有染料的底物，经酶催化反应产生荧光物质，如蛋白酶介导的肽氟基团裂解。燧石会受到许多因素的影响，如被测物质的自发荧光和猝灭(与被测物质而不是底物相互作用)和取样误差。一般来说，用于标记的染料的激发波长越长，来自屏蔽化合物的光谱干扰就越少。
2. 荧光比率法
常用的高温超导屏蔽系统包括荧光偏振(FP)和荧光各向异性(FA)检测。与燧石相比，这种方法不容易受到人为因素的影响。通过测量分子在一定时间内的旋转变化，表征了相互作用对分子测定的影响。在这些技术中，偏振光用于激发荧光团，并使用平行于和垂直于入射光偏振的偏振光测量荧光发射。当染料标记分子随时间翻转时，发出的信号去极化。与大分子结合降低荧光团的迁移率，从而增加极化值或各向异性，并允许定量结合。由于不同荧光素的荧光寿命不同，利用这一特性可以使筛选体系的灵敏度最大化。荧光素、罗丹明等有机染料的荧光寿命约为3-4 ns，与约0.5-10 kD的分子结合时，检测灵敏度最高。因此，荧光比法最适合测定分子量差较大的分子相互作用。
3.荧光共振能量转移
来自荧光供体的能量通过偶极-偶极相互作用被受体吸收。能量转移的效率取决于施主和接受者之间的光谱重叠，它们的距离和相对取向，以及福斯特方程中的其他参数。共同的供能受体距离为26 nm，适合于多种蛋白质-蛋白质相互作用。
4.时间分辨荧光共振能量转移
是一种从荧光共振能量转移中衍生出来的筛选方法。
具有较长荧光寿命(通常为100秒至毫秒)的镧系化合物用作荧光供体，荧光蛋白或有机荧光团(例如，别藻蓝蛋白或Cy5)用作受体。然后对受体的荧光发射进行门控(例如，延迟到50ms)，以便在采集信号时，待测化合物中短命有机荧光团的荧光发射已经减弱。一个典型的商业分子库的荧光寿命在皮秒范围内。此外，350 nm供体激发和670 nm受体发射之间的大Stokes位移进一步有助于最小化背景信号。镧系化合物的荧光发射也出现在多个窄波长，这与有机染料的宽波长发射不同，它允许与荧光受体多路复用。
二、基于亲和力的筛选体系
结合分析直接观察文库化合物与靶蛋白的结合，而不考虑它们对蛋白质功能的影响。上述生化方法测量酶/受体功能的变化或探针/蛋白质结合的抑制。一般来说，基于结合剂的检测方法使用的生物物理技术比基于竞争的筛选方法更需要材料和时间，因此最常用于小型化合物库。基于结合的方法也被用于挑战孤儿靶点和药物发现过程的后期阶段，如芽化合物验证、优化和先导化合物优化。
三、基于细胞的筛选体系
化学探针和药物先导物的发现不仅基于它们与特定靶标的相互作用，而且还基于它们诱导细胞/生物体表型的能力。通常使用基于细胞/生物学的筛选:1)理想的分子靶标未知;2)生化方法不能完全复制目标反应体系;3)理想的表型只存在于细胞环境中，如细胞分化。功能结果也可以提供大量的机械信息，如区分完全激动剂，部分激动剂，反向激动剂，和变构调节剂。异质性也可以测量，特别是当细胞可以为高含量成像可视化。最后，基于细胞的方法也可以报道化合物的膜通透性和细胞毒性，这是结构药物开发失败的主要原因。基于细胞的方法可以应用于药物发现的整个过程:目标识别和验证、初步筛选、先导物识别、先导物优化以及安全性和毒性筛选。常用的方法有细胞增殖法、第二信使法、报告基因法、蛋白片段互补法、酵母杂合子法、显微分析法等。单元模型的选择至关重要。在人类建模中，细胞系经常被修改以携带报告基因或其他特征。目前的趋势是建立更多的“疾病样”模型，包括原代/患者来源的细胞和涉及3D细胞培养或多细胞物种的复杂培养。人们对使用灌注培养和其他微流控装置来评估化合物对细胞的长期影响也越来越感兴趣。此外，小动物模型，如线虫和斑马鱼，越来越多地被用作小分子筛选的高通量模型。
四、结语
进行药物开发目前有两条热门的途径，其一是根据基础研究选择具有重大意义的疾病靶标，特异性设计HTS的筛选方法，选择合适的靶向药物库进行筛选，利用多重方法进行苗头化合物和先导化合物的鉴定与验证。其二是根据疾病特征性选择合适的表型模型，根据表型的特征性，选择合适的表型筛选体系进行表型筛选实验，获得先导化合物后进行靶标去卷积鉴定和验证作用靶标，可再结合基于结构的药物筛选进行进一轮的结构优化提升药效，综合各药物设计策略的长处，开发原创新型药物。
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