卿晋 张钰 付兰 普加宏 黄莓屏*
昆明市第一人民医院皮肤科 云南 昆明 650011
【摘要】目的 评估真菌荧光染色法在马拉色菌相关疾病诊断中的应用价值。方法 我院皮肤科门诊对122例临床疑似马拉色菌感染病例的头、面部和胸背部样本分别采用荧光染色法与美蓝染色法进行直接镜检，比较其检验结果。结果 122例患者中，头皮、面部和胸背部标本应用荧光染色法和美蓝染色法镜检阳性率分别为65.21%和26.08%,50.79%和31.74%,69.23%和30.76%,荧光染色法阳性检出率较高,差异有统计学意义(P<0. 05)。结论 真菌荧光染色法在马拉色菌相关疾病诊断中是一种快速、准确的诊断方法。
[关键词] 马拉色菌；真菌荧光染色；美蓝染色
马拉色菌为马拉色菌相关疾病的病原菌，与马拉色菌毛囊炎、头皮屑过多、脂溢性皮炎、痤疮等疾病有关。在临床检测中常规 KOH 涂片镜检方法，常因圆形均质的暗绿色反光颗粒的脂肪滴与马拉色菌孢子极其相似而易混淆，对马拉色菌的检测敏感度已不能很好地满足临床要求，难以获得满意效果1。目前，真菌荧光镜检在皮肤科中应用非常广泛,该检测手段比传统的KOH湿片法及染色法准确度更高,可在镜下直接观测到真菌的数量及形态，具有快速、简便、灵敏的优点2。而美蓝染色法在马拉色菌相关疾病诊断中亦具有良好的染色效果。因此，笔者对目前应用于临床的真菌荧光染色（一步法）和美蓝染色2种方法进行了比较分析。本研究对我科门诊122例临床疑似马拉色菌感染病例的头、面部和胸背部样本进行染色效果及阳性率比较，报告如下。
1 材料和方法
1.1 病例来源
收集2019年11月～2020年4月我院皮肤科门诊122例疑似马拉色菌感染者的临床标本。患者年龄14～64岁，男59例，女63例。对比两组资料无统计学意义（P＞0.05），可开展比较。
1.2 染色液（试剂）
真菌荧光染色液（立特晰，安徽德莱康生物医疗科技有限公司生产，主要成分：氢氧化钾（KOH）、荧光素、蓝色背景压制剂、其他、纯水）；荧光显微镜（徕卡DM500）。美蓝染色液：用蒸馏水加美蓝配制成0.2%浓度再滴加几滴配制好的氢氧化钾溶液（0.1ml）。
1.3 取材及染色方法
黄莓屏* 通讯作者 1076781401@qq每例患者均于皮损处取2份标本，同时进行真菌荧光染色和美蓝染色。选择患者头、面部和胸背部基本一致的红丘疹或皮屑进行取材，取其丘疹内容物或皮屑，每例患者取2份标本用于2种染色。以碘伏消毒皮损，用钝刀片刮取病变皮屑或挤出丘疹内容物，分别涂布于2张洁净的载玻片上备用；对面部皮屑少者，则用市售透明胶带(宽 1cm)在患者面颊近鼻翼处取材，放置于玻片上；分别以荧光显微镜或普通光学显微镜镜下检测。
1.3.1 荧光染色法 直接向样本滴加一滴立特晰真菌荧光染色液，染色液以覆盖或淹没整个样本为准，盖上盖玻片，使用棉签或纸巾压片，使标本尽量压成薄片，吸去多余染液，数秒钟后于荧光显微镜下观察。
1.3.2 美蓝染色法 直接向样本滴加1滴美蓝染色液，或将胶带均匀贴附在滴有美蓝染色液的玻片上，将玻片放置3-5 min，置于普通光学显微镜下观察。先在中低倍镜下寻找视野中可疑的染色阳性菌体，再以高倍镜证实并记录。
1.3.3 采用SPSS21.0软件进行统计分析。采用ROC X2检验比较荧光染色法与美蓝染色法的阳性检测结果
2 结果
122例患者中，头、面部和胸背部荧光染色阳性分别为30、32、9例，美蓝染色阳性分别为12、20、4例，二者间阳性率有显著差异。
2.1 头皮检测结果比较分析 采用荧光染色法与美蓝染色镜检法对头皮样本进行检测，结果如表所示，荧光染色法检出率比美蓝染色法检出率高，分别为65.21%和26.08%,,两者差异有统计学意义(х2=14.19,P<0. 05)。
2.2 面部测结果分析 荧光染色法和美蓝染色法阳性检出率分别为50.79%和31.74%,荧光染色法检出率较高,差异有统计学意义(х2=4.05,P<0. 05)。
2.3 胸背部检测结果分析 采用荧光染色法与美蓝染色镜检法阳性检出率分别为69.23%和30.76%,两者差异无统计学意义(х2=3.84 ,P=0. 05)。
不同部位2种染色方法的阳性率比较[例数(%)]
标本来源 荧光染色法 美蓝染色法 х2 P
阳性 阴性 阳性 阴性
头皮（n=46） 30（65.21%） 16（34.78%） 12（26.08%） 34（73.91%） 14.19 0
面部（n=63） 32（50.79%） 33（52.38%） 20（31.74%） 43（68.25%） 4.05 0.04
胸背部（n=13） 9（69.23%） 4（30.76%） 4（30.76%） 9（69.23%） 3.84 0.05
总计（n=122） 71（58.19%） 53（43.44%） 36（29.50%） 86（70.49%） 19.26 0
2.4 标本被标记荧光，镜下可见清晰的亮蓝色真菌轮廓，真菌荧光与背景形成强烈反差，图像清晰，孢子的出芽形态也能被呈现出来，出芽成葫芦形、瓜子形，易于识别（图1、2）。而其他物质（如脂细胞、磷脂小球、水泡）不着色。
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标本经美蓝染色后，可见椭圆形、葫芦形的蓝紫色酵母孢子，边缘着色深，轮廓较为清晰，脂滴、气泡等背景中的杂质不着色，皮屑亦染成深蓝色1（图3、4）。
图4
3 讨论
作为条件致病菌,马拉色菌(Malassezia pachydermatis)与多种人及动物皮肤疾病相关,包括直接感染皮肤组织所致的花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎；通过免疫机制参与某些疾病的发生发展,如,脂溢性皮炎、特应性皮炎、痤疮、甲真菌病、银屑病、包皮龟头炎、外耳道炎、融合性网状乳头瘤病等3。
临床中，经典的KOH湿片法背景杂乱，真菌与背景反差小，真菌结构不易分辨和判断。常规KOH涂片法对于马拉色菌的检测敏感度已不能很好地满足临床要求1。而真菌荧光染色液适用于各种人体组织样本，包括皮肤、甲屑、毛发、痰液、肺跑灌洗液、脓液、体液、眼、外耳道及阴道分泌物等。通过荧光标记技术，在荧光显微镜下定性检测真菌。利用特异性发光标记物共价结合在β-糖苷基团，形成β多糖-荧光素复合物而发出特异荧光。真菌细胞壁多糖，如几丁质和葡聚糖，荧光素可特异性标记真菌多糖抗原，形成强的荧光复合物，通过340～400 nm滤镜的荧光显微镜下观察，判断真菌的存在：可见真菌轮廓清晰，反应灵敏，图像对比度高，镜下易于观察，镜检阳性率显著提高，可减少漏诊的发生。而且干扰因素少，避免经验上的主观判断，结果更加客观、真实。
美蓝作为一种细胞染色剂，其染色方法是利用美蓝染料对组织蛋白、菌体（多糖成分）有异染性,染色过程需将玻片放置3-5 min，使皮屑标本充分溶解，使菌体与染色液较好结合1 ；但我们做出的结果菌体呈紫蓝色，背景呈蓝色或淡蓝色，对比度欠佳，有时难以分辨。
经比较研究表明，荧光染色法阳性检出率显著高于美蓝染色法(х2=19.26，P<0. 05)。二者相比较，真菌荧光染色法简便快捷，仅需1滴染色液立即压片即可荧光显微镜观察，而且镜下背景反差较大，图像清晰，相比于美蓝染色法更易于观察，省时省力。我科的美蓝染色法，菌体染成紫蓝色，与背景不易区别，而非钟白玉等1所做的紫红色，易与脂滴、细胞间隙相鉴别；究其原因，是我们配制美蓝染液，未加用95%乙醇，只加入蒸馏水，使得我们的染色对比度不高，阳性检出率低。他们的方法较好，染色差别大，阳性检出率高，对于初学者易于常握，只是耗时较长，不方便多样本操作。我们将改进实验方法，继续检验美蓝染色法的优劣。综上，真菌荧光染色法方便快捷，在马拉色菌相关疾病诊断中具有更好的染色效果，值得推广应用。
【参 考 文 献】
1.钟白玉，徐 艳等，荧光染色、PAS染色和美蓝染色在马拉色菌毛囊炎诊断中的比较，实用皮肤病学杂志 2018年6月第11卷第3期 ，149-150,154
2.莫慧慧，荧光镜检法检测皮肤真菌的定植量及其在炎性皮病中的变化，南方医科大学，硕士 2020
3.尹斌 冉玉平，马拉色菌临床鉴定研究进展,中华皮肤科杂志,2014第12期：912-914
黄莓屏* 通讯作者 1076781401@qq