钟展华 , 张国良
惠州市中心血站，广东 惠州516003
摘要：目的：评估惠州地区无偿献血群体中新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸的携带情况。方法：利用现用8混样血液核酸筛查平台（血液筛查HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA）所提取纯化的血液标本核酸产物，采用实时荧光定量PCR技术对SARS-CoV-2的ORF1ab、N基因区段进行扩增检测。结果：对16777份无偿献血者的血液标本进行了SARS-CoV-2核酸筛查，未检出SARS-CoV-2核酸呈反应性的献血者标本。结论：适时监测与评估无偿献血群体中SARS-CoV-2的携带情况，能够为采供血工作应对措施的调整提供参考依据，以保障采供血工作和临床用血的安全。
关键词 SARS-CoV-2 核酸筛查 血液安全
前言
自2019年12月武汉发现新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染以来，其在全国及世界范围造成了广泛的传播；其在感染人体后可引起冠状病毒疾病（COVID-19）的发生，给整个卫生体系和公众健康都带来了巨大的挑战。目前，我国疫情已得到有效控制，但仍存在着一些地区散发出现新增感染病例的情况。同时，国外整体疫情仍未见明显好转，给我国持续带来严峻的疫情输入压力。而研究又发现在COVID-19患者的血清或血浆中可以检测到SARS-CoV-2 RNA的存在 [1]，这给采供血工作和血液安全带来了潜在的风险和威胁。为此，我们对惠州地区无偿献血群体中SARS-CoV-2核酸的携带情况进行了筛查和评估，现报告如下。
材料与方法
1研究对象
2020年4月至2020年7月惠州市中心血站符合《献血者健康检查要求》的无偿献血者，经酶联免疫筛查HBs-Ag、抗-HCV和抗-HIV后结果均为阴性的16777份血液标本。
2试剂
科研试剂：新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）（苏州华益美生物科技有限公司提供），灵敏度为10IU/ml。
核酸提取试剂使用血液筛查HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA所用检测试剂中的相关核酸提取组分。我站在用的核酸筛查试剂为：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）（苏州华益美生物科技有限公司）
3 仪器设备
STAR自动化核酸提取工作站（瑞士Hamilton公司）
ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国AB公司）
4 实验方法
SARS-CoV-2核酸检测实验涉及到的实验室管理、人员防护和操作要求均按照二级生物安全实验室的相关要求进行。
科研筛查试剂采用TaqMan实时荧光PCR技术，结合多重PCR方法对SARS-CoV-2的ORF1ab、N基因片段和内对照在同一个反应管内进行甄别检测。其内对照与在用血液核酸筛查试剂中的外源性内对照完全相同。在实际实验中，核酸提取环节使用了在用血液核酸筛查试剂中的内对照。
血液检测SARS-CoV-2核酸的检测采用8混样模式，每份标本取样150μl形成体积1.2ml汇集Pool，进行后续的核酸提取和扩增检测。对呈SARS-CoV-2核酸反应性的汇集Pool，进一步对该汇集Pool内的血液标本进行确认检测（每份标本取样1.2ml，核酸提取和扩增过程与混样检测一致）。混样检测与确认检测时每个核酸提取孔中添加的核酸洗脱液体积均为100μl。
血液标本的核酸提取结合了我站在用的血液核酸筛查平台，使用在用血液核酸筛查试剂完成血液标本的核酸提取，核酸提取采用磁珠法进行。在获得纯化的核酸模板后，同步完成SARS-CoV-2核酸扩增检测PCR反应体系的构建（体系组成见表1）。
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使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪进行扩增检测，扩增程序为20℃ 5min，42℃ 35min，94℃ 10min，（94℃ 10s，55℃ 15s，65℃ 45s）×45（65℃时采集所有荧光信号）。
依照试剂说明书要求进行检测结果的判定，每批实验均设置阴性对照与阳性对照，同时满足阴性对照只有外源性内对照呈反应性，阳性对照ORF1ab与N基因均呈反应性时，该批实验有效，否则该批实验无效。对检测孔的判定方法为：ORF1ab与N基因扩增检测均呈非反应性时，判定该检测孔呈SARS-CoV-2 核酸非反应性；ORF1ab与N基因扩增检测均呈反应性时，判定该检测孔呈SARS-CoV-2 核酸反应性；ORF1ab与N基因只有1个呈反应性时，判定该检测孔需要重复检测，重复检测时至少ORF1ab与N基因其中1个呈反应性时，判定该检测孔呈SARS-CoV-2反应性，否则判定该检测孔呈非反应性。
呈SARS-CoV-2 核酸反应性的混样检测孔对应的标本全部进行确认检测，确认检测时的判定方法与上述判定方法一致。
结果
完成了16777例献血者血液标本的SARS-CoV-2的核酸筛查，8混样模式下，ORF1ab与N基因均未有呈反应性的检出，即未检出SARS-CoV-2核酸呈反应性的汇集Pool和SARS-CoV-2核酸呈反应性的血液标本。
讨论
冠状病毒(Cov)是已知最大的RNA病毒，其分为α-CoV，β-CoV，γ-CoV和δ-CoV四个属[2]，在SARS-CoV-2之前，同属β-CoV的可引起严重急性呼吸系统综合征的SARS-CoV和中东呼吸综合征的MERS-CoV，均在患者血清或血浆中可以检测到病毒核酸的存在[3.4.5]，而引发人们对病毒是否可以经输血感染传播的担忧，虽然未有血源性传播记录和明确的证据来表明，但从理论上讲，仍然存在着这一可能性[6]。
与SARS-CoV和MERS-CoV不同的是，除多项研究发现在COVID-19患者血清或血浆[1.7.8]及外周血单核细胞[9]中可以检测到SARS-CoV-2 RNA的存在外。SARS-CoV-2在感染人体后存在着更长的潜伏期，最长可达24天[10]。同时在COVID-19患者中，尤其是作为无偿献血适龄人群的青中年患者，很多存在无发热现象或仅具有轻微症状的状况[11]。另外，叠加SARS-CoV-2无症状感染者的发现和存在[12.13]，且可能已具备传染性[14]的情况。这些都使得献血者在无意识自身已感染SARS-CoV-2的情况下进行献血的可能性进一步增加[11]。同时我国无论在献血群体规模还是在采供血量上都较SARS时期有了长远的发展。可以看出，SARS-CoV-2给采供血工作和血液安全带来了更大的挑战。
为应对SARS-CoV-2可能对采供血工作带来的的潜在风险。国家卫健委要求采供血机构增加献血者的相应健康征询，暂缓具有流行病学史，体温异常或有干咳症状的献血者献血。在这些措施和目前的疫情防控下，血站可能或更多面临的是无症状感染者所带来的风险。虽然也有研究发现无症状感染者的血液中检测不出SARS-CoV-2 RNA的存在，认为即使在COVID-19患者血清或血浆中可以检测到病毒核酸的存在，也不代表着血液中携带着能够感染组织的SARS-CoV-2完整病毒，并造成血源性的感染和传播，但作者同时也表述了经血液成分是否可以传播SARS-CoV-2及可能存在的风险仍需要进一步研究[15]。的确，SARS-CoV-2感染人体的确切机制和进程有待更多的研究来明确。但无论是考虑受血者的健康还是采供血机构工作人员的实际工作，仍需要给予SARS-CoV-2足够的适时关注和相应的策略调整。在本研究中，令人欣慰的是未筛查出SARS-CoV-2核酸呈反应性的献血者血液标本，这可能与4月份以来惠州地区的SARS-CoV-2流行状况得到较好、有效的控制有一定的相关性。随着SARS-CoV-2疫情可能出现的反复及“常态化”，适时监测与评估无偿献血群体中SARS-CoV-2核酸及抗体的携带情况，对采供血工作的措施调整和保障采供血工作、临床用血的安全都有着有重要的意义。
参考文献
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