张惠 李友邦 蓝晓玉 李紫嫣 方艺璇
广西师范大学，广西 桂林 541006
摘要：以广西梧州动物研究所黑叶猴为研究对象，在微观水平上，通过高通量测序的方法对黑叶猴粪便肠道菌群的DNA进行定量检测；宏观水平上，在掌握灵长类肠道菌群的类型并配制相应选择培养基的基础上，对黑叶猴粪便中的微生物进行分离与纯化，最终通过对各培养基的菌群染色鉴定，分析得出黑叶猴肠道菌群种类及数量分布，探讨黑叶猴肠道共生菌群与能够消化纤维素、取食植物的有毒部分这一独特生态位之间的联系。整个实验结果能够解释实验过程出现的各种实验现象，说明了黑叶猴肠道微生物是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，黑叶猴肠道微生物大致属于以下四个属：拟杆菌属（Bacteroidetes)、疣微菌属（Verrucomicrobiota)、变形菌属（Proteobacteria）、厚壁菌属（Firmicutes)。并且各属中的各物种表明黑叶猴肠道微生物有致病菌和调节肠道功能的菌落。说明黑叶猴肠道内的菌群相互作用、相互制约共同形成了一个稳定的肠道系统，从而维持了机体的健康。其中中黑叶猴肠道菌群中的优势菌群是在纤维物质消化中起主要作用的厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes)。
关键词：黑叶猴 肠道菌群 微生物 粪便 共生菌群
Isolation culture and identification of intestinal microorganisms in langur
Zhang hui Li you-bang Lan xiao-yu Li zi-yan Fang yi-xuan
【Abstract】Taking the black langur of Guangxi Wuzhou Institute of Zoology as the research object, at the microscopic level, the DNA of the fecal intestinal flora of the black langur was quantitatively detected by the method of high-throughput sequencing; at the macro level, the intestines of the primates are mastered. On the basis of the type of the tract flora and the preparation of the corresponding selection medium, the microorganisms in the black langur feces are separated and purified, and finally through the identification of the bacterial flora of each medium, the intestinal flora of the black langur is obtained by analysis The species and quantity distribution, to explore the relationship between the intestinal symbiotic flora of the black leaf monkey and the unique ecological niche that can digest cellulose and feed on the toxic parts of plants. The results of the whole experiment can explain various experimental phenomena during the experiment. It shows that the intestinal microorganisms of the black langur are Gram-positive or Gram-negative bacteria, and the intestinal microorganisms of the black langur generally belong to the following four genera: Bacteroidetes, Verrucomicrobiota, Proteobacteria, Firmicutes. And each species in each genus indicates that the intestinal microbes of the black langur have pathogenic bacteria and colonies that regulate intestinal function; but because too few samples sent for sequencing, it is impossible to explain whether most black langurs have intestinal pathogens.The?results?showed?that?the?intestinal?flora?of?langur?interacted?and?restricted?each?other?to?form?a?stable?intestinal?system,?so?as?to?maintain?the?health?of?the?body.?Among?them,?Firmicutes?and?Bacteroidetes,?which?play?an?important?role?in?the?digestion?of?fibrous?substances,?are?the?dominant?flora?in?the?intestinal?flora?of?the?middle?black?leaf?monkey,?which?is?related?to?the?feeding?habits?of?the?black?leaf?monkey.
Key word:Trachypithecus?francoisi;Intestinal flora;microorganism;feces ;Symbiotic flora
黑叶猴(Trachypithecus francoisi）是生活在喀斯特石山的特有灵长类动物,仅分布于越南北部和我国的广西、贵州、重庆的部分石山地区。由于非法捕杀和栖息地被破坏,黑叶猴的种群数量急剧减少。石山地区缺乏地表径流,植物的生长受降雨量的影响更加显著,加剧了黑叶猴食物的季节性差异[1]。但有研究证实,食物不充分会降低灵长类的繁殖能力和生存能力。因此,在食物资源波动较大的石山生境中,黑叶猴如何获取足够的食物及对所取食食物的要求成为该物种生存的关键。黑叶猴属于典型的叶食性灵长类,纤维质食物占总觅食记录的71%，包括46.9%的嫩叶和24.1%的成熟叶。相似的结论也见于其他其它黑叶猴种群的觅食生态学研究[2] 。对生活在扶绥保护区内的黑叶猴的食性研究发现,树叶占总觅食时间的94%。在贵州麻阳河自然保护区,黑叶猴花费63.9%时间觅食树叶。其中,嫩叶为黑叶猴喜好采食的食物,它在食物中所占的比例随着可获用性的增加而明显增加。在麻阳河地区,嫩叶在黑叶猴食物组成中的比例与其可获得性之间存在显著的正相关。然而,黑叶猴不同地理种群的食物组成仍存在显著差异。与扶绥黑叶猴相比,弄岗黑叶猴采食更多的果实和种子较少的树叶[3]。
肠道微生物是寄居在宿主肠道的巨型基因库，所包含的基因数目是人类自身基因组的100倍，其特异性的代谢和酶系统广泛地参与到动物机体的蛋白质、糖类、脂类、矿物离子代谢及维生素合成等生命活动过程中，组成了结构复杂、数量庞大的肠道微生物组[4]。因此，对微生物在肠道的生长发育过程的影响机制，肠道免疫屏障的建立与维护，食物的消化、营养成分的吸收及肠道疾病产生与转归及肠道不同菌群之间的相互影响等过程进行科学系统的研究是十分有意义的。目前，世界各国和我国医学界，都把注意力转移到对正常微生物群的研究。已对人进行了比较多的正常肠道菌群的定性、定量研究，证明人体正常肠道内约有100种以上的细菌，其总数超过1011个/g粪便，但90%～ 99%为厌氧菌，1997年Mitsuoka等报道了猪、鸡等12种动物的肠菌群组成[5,6]。目前，关于灵长类肠道微生物系统的研究仍较少，迄今为止，国内外还未展开有对黑叶猴肠道正常菌群的研究工作。
基于上述背景，本研究选取广西梧州动物研究所的黑叶猴为研究对象，开展对黑叶猴肠道正常菌群的分离培养与鉴定的研究，以期回答如下科学问题：为什么黑叶猴的肠道能够消化纤维素、果胶等植物特有成分并喜以鲜嫩树叶为食？黑叶猴能够取食植物有毒部位这一独特的生态位与肠道菌群有何联系？肠道菌群在黑叶猴对喀斯特石山环境的食性适应要求上发挥什么生化作用？不同地区的黑叶猴其喜食的植物部分异同的基础是生存环境使然还是肠道优势菌群作为关键因子？这些科学问题的合理解答与补充，不仅可以为黑叶猴保留原始喀斯特石山环境下的食性的深入认识提供科学依据，而且还可以为黑叶猴肠道健康的检测、生境多样性的研究、防治其消化道疾病工作提供理论指导，丰富珍稀灵长类的肠道正常菌群数据。
1 材料与方法
1.1研究地点和对象
本研究的动物驯养于广西梧州动物研究所（东经111.341208，北纬23.475915），该所对黑叶猴实施易地保护，通过人工圈养的方式建立起能够自我维持的人工种群，饲养有近100头黑叶猴
驯养的黑叶猴一般来自附近林区嫩叶，也会喂食花生、果蔬、南瓜、冬青叶枝条等。黑叶猴一般由研究所饲养员喂食，14：00-15：00是喂食时间。团队成员于2020年7月16－日17：00-19：00取样，由于条件限制，取样时间不是最佳，而是在黑叶猴排便后两至三小时内，粪便混杂并且边缘出现干燥。
1.2样品采集及样品处理
团队成员于2020年7月16－日17：00-19：00取样，由于条件限制，取样时间不是最佳，而是在黑叶猴排便后两至三小时内，粪便混杂并且边缘出现干燥。
取样前戴好防护，取样时用不锈钢勺轻轻拨开边缘干燥部分，取粪便中央湿润部分，并将不同的粪便用密封袋密封，共取样十一袋粪便（不分年龄、性别）。在研究所超冷冻冰箱冰冻四小时后用保温冰箱运送回广西师范大学伯康楼实验室，置于4℃冰箱内保存。在项目期间，团队共取样一次，制作不同个体粪便稀释液两次，分离纯化后的菌群在甘油－20℃保存。
1.3黑叶猴肠道微生物的富集培养
制作菌悬液：盛样品粪便5g，放入盛有50mL蒸馏水的三角烧瓶中制成粪便悬液，摇床摇30min-1h。
制备梯度稀释液：从粪便悬液中吸取0.5mL加入盛有4.5蒸馏水的大试管中摇匀，制成10-1稀释液，再用吸管从此支试管中吸0.5mL加入另一支盛有4.5mL蒸馏水的试管中，摇匀。以此类推，制成到10-6，不同稀释度的粪便溶液，取10-4，10-5，10-6涂布到LB培养基、牛肉膏蛋白胨培养基以及羊血培养基上。
涂布以及培养：
（1）涂布：将上述每种培养基标好10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用分别由10-4，10-5，10-6三支试管粪便稀释液中各吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5-10min，使菌液浸入培养基。
（2）培养：将淀粉培养基平板倒置于37°C培养箱中培养24-48h
1.4黑叶猴肠道微生物划线分离与保存
取菌落涂片，革兰染色、镜检。根据培养基菌落的形态、大小、颜色、革兰染色特性以及细菌的形态、大小、排列等特点将它们筛选并划线分离培养。分离所用的培养基对应菌种富集培养时所用的培养基。将培养基平板倒置于37°C培养箱中培养24-48h。成功分离单菌落后刮取不同菌落以相应不同的液体培养基36 ℃振荡培养48 h，取菌液混合甘油（甘油体积比为15%） -20℃ 保存。将培养后不同菌落直接送北京百迈客生物科技有限公司测序。
1.5黑叶猴粪便 DNA 的提取
粪便 DNA 的提取：
取黑叶猴粪便 6~7 粒（约 600mg）于 5mL 离心管中，用镊子将其夹碎，加入2mL0.9%的生理盐水，间歇振荡 1min 至样本混匀，12000r/min 离心2min，弃上清液。向沉淀中加入 2 mL 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB ）裂解缓冲（CTAB 55 mmol/L,NaCI1 .4 mol/L,pH 8. 0 的 Tris-HCl 100 mmol/L , pH80 的EDTA 20mmo/L）振荡混匀 30s 置 65°C 水浴 2h。将上述裂解液涡旋15s, 12 000r/min 离心 4min，转移上清液 1.5ml 全新的 5ml 离心管等体积加入饱和酚氯仿异戊醇（V（饱和酚） : V（氯仿） : V（异戊醇）=25 :24 : 1）间歇振荡10 min, 12 00r/min 离心 10min。取上清液至新的 5mL 离心管重复该步骤 1 次。取上清液按 10: 1 : 20 的体积比分别加入上清液、3mol/L NaAc 和冰预冷无水乙醇温和地上下翻转数次，混匀后置 20°C 冰箱 1h。将提取液 12 000r/min 离心 10min，弃上清，加入 1mL 体积分数 70%的乙醇溶液，用移液器轻轻吹打混匀，12000r/min 离心 2min，弃上清室温放置数分钟至沉淀干燥。加入 200μL TE 无菌混匀溶解沉淀，最后用普通产物纯化试剂盒进行纯化，得到的黑叶猴粪便基因组 DNA 置 20°C 冰箱保存备用[7]。
PCR 扩增：
采用 16s rRNA 引物为： 27f 和 L1492R 反应条件为：95℃预变性 5min; 95℃变性 40s; 52℃退火30s; 72℃延伸 50s, 30 个循环：最后 72℃延伸 7min,4℃保存。
1.6黑叶猴肠道微生物菌群组成及其多样性测定
本研究利用单分子实时测序（SMRTCell）的方法对marker基因进行测序，之后通过对CCS（CircularConsensusSequencing）序列进行过滤、聚类或去噪，并进行物种注释及丰度分析，可以揭示黑叶猴肠道微生物的物种构成；进一步进行α多样性分析（AlphaDiversity）、β多样性分析（BetaDiversity）和显著物种差异分析、相关性分析、功能预测分析等等，可以挖掘样品之间的差异。从获取的数据中导出CCS序列，对CCS序列进行Barcode识别，长度过滤，去除嵌合体，得到EffectiveCCS；然后将EffectiveCCS序列进行聚类/去噪，划分OTUs/ASVs（后面统一称之为Feature），并根据Feature的序列组成得到其物种分类；再基于特征（Feature）分析结果，对样品在各个分类水平上进行分类学分析，获得各样品在门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构图、物种聚类热图、属分类学水平系统进化发生树及分类学树状图；并通过Alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，统计了各样品在97%相似度水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指数，绘制了样品稀释曲线及等级丰度曲线。本工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
2 结果
2.1黑叶猴肠道微生物菌落的组成
黑叶猴肠道微生物菌群在门分类级别上，分属于4个门：Bacteroidetes 拟杆菌门、Firmicutes厚壁菌门、Proteobacteria变形菌门、Verrucomicrobiota疣微菌门，其中变形菌门和厚壁菌门占绝对优势（表1，图1）。
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纲分类级别上，在LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基分离出的肠道微生物菌群属于Gammaproteobacteria变形菌纲、Bacilli芽孢杆菌纲、Bacteroidia拟杆菌纲、Verrucomicrobiotae疣微菌纲，其中大多都集中于Gamma proteobacteria（变形菌纲）、Bacilli（拟杆菌纲）（图2）。
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在目分类级别上，在LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基分离出的微生物菌群分属于Lactobacillales乳纲菌目、bacteroidales拟杆菌目、Verrucomicrobiales疣微菌目、Enterobacterales肠杆菌目、Staphylococcales（图3）。
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在科分类级别，主要为Prophyromonadaceae紫单胞菌科、Akkermansiaceae疣微菌科、Enterococcaceae肠球菌科、Staphylococcaceae葡萄球菌科、Enterobacteriaceae肠杆菌科（图4）。
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在属分类级别上，分离出的肠道微生物属于Porphyromonas卟啉单胞菌属、Akkermansia艾克曼菌属、Enterococcus肠球菌属、Staphylococcus葡萄球菌属、Escherichia埃希氏杆菌属（图5） 。
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在种分类级别，卟啉单胞菌Porphyromonas_somerae、艾克曼菌Akkermansia_muciniphila、海氏肠球菌Enterococcus_hirae、慢葡萄球菌Staphylococcus_lentus、大肠杆菌Escherichia_coli，其中大肠杆菌占比最大，属于正常现象（图6）。
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Chao1和Ace指数衡量物种丰度即物种数量的多少。Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度（Community evenness）的影响。相同物种丰度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性，Shannon指数和Simpson指数值越大，说明样品的物种多样性越高[6]。另外还统计了覆盖率（Coverage），其数值越高，则样本中物种被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。黑叶猴肠道微生物菌群Alpha 多样性指数见表2。
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3 分析
3.1黑叶猴肠道菌群物种与功能组成分析
有研究表明,非人灵长类肠道菌群基本上是由来自12个门的细菌组成的,其中,拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是优势菌门[9]，本研究中从分离的肠道微生物来看符合前人的研究结果。本研究显示：门水平上，厚壁菌门和变形菌门在肠道微生物的组成中属于优势群体，表明黑叶猴肠道菌群组成以及各菌门间的趋势与多数哺乳动物相似。另外有研究发现，大肠杆菌感染是引起黑叶猴腹泻的主要原因之一，乳酸菌和大肠杆菌被认为是指示肠道健康的主要菌群，消化道中乳酸菌与大肠杆菌的比值可作为检测肠道菌群平衡的指示指标，乳酸菌数量高于大肠杆菌数量能够促进有益菌对肠道病原菌抑制作用的发挥。在本试验大肠杆菌占比过多以及存在肠球菌，说明该黑叶猴可能存在一定的肠道感染并可能存在一定的耐药性。与之相对应的本实验中还发现了嗜黏蛋白－艾克曼菌（Akkermansia），其具有加强保护肠道的功能，并且可以影响肠道黏液层厚度，对其功能也起到改善作用，维持了肠屏障完整性，这说明黑叶猴肠道中可能调节肠道功能的菌群。结合以上分析可知黑叶猴肠道内的菌群相互作用、相互制约共同形成了一个稳定的肠道系统，从而维持了机体的健康。
本研究中黑叶猴肠道菌群中的优势菌群是在纤维物质消化中起主要作用的厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes)，这与黑叶猴采食树叶等食性相关[10]且与文献报道一致。Thomas和Kim[11‘12’]等研究表明拟杆菌门菌群有利于胃肠道的正常发育，它们可以产生丁酸盐，而丁酸盐是结肠发酵的主要产物，具有抗肿瘤和保持肠道健康的特性。而梭菌属是肠道中主要的纤维降解菌，能有效降解半纤维素和纤维素，释放可溶性寡糖，以及普雷沃氏菌属（ Prevotella）等可帮助黑叶猴分解树叶中的纤维素及降解树叶中的结构性碳水化合物。这两属均没有发现，可能是因为测序样品过少，实验结果存在一定局限性，但梭菌属属于革兰阳性菌，符合实验现象。
3.2 Alpha多样性分析
Simpson指数用于衡量物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度（Community evenness）的影响。本试验通过Alpha多样性（Alpha diversity)?分析黑叶猴粪便样品中的菌群丰度。通过对Alpha多样性指数分析发现，两个样品中ACE和Chao1指数相同，即表明在两种培养基中培养所得的物种数量相同。而样品LB的Simpson指数和Shannon指数相较于样品NB来说比较大，说明LB样品的物种多样性更高。因两个样品的Coverage指数都为1，说明两个样品的测序结果代表的微生物真实情况相同。
4 结论
本研究表明整个实验结果能够解释实验过程出现的各种实验现象，说明了黑叶猴肠道微生物是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，黑叶猴肠道微生物大致属于以下四个属：拟杆菌属（Bacteroidetes)、疣微菌属（Verrucomicrobiota)、变形菌属（Proteobacteria）、厚壁菌属（Firmicutes)。表明黑叶猴肠道菌群组成以及各菌门间的趋势与多数哺乳动物相似。并且各属中的各物种表明黑叶猴肠道微生物有致病菌和调节肠道功能的菌落；说明黑叶猴肠道内的菌群相互作用、相互制约共同形成了一个稳定的肠道系统，从而维持了机体的健康。
本研究中黑叶猴肠道菌群中的优势菌群是在纤维物质消化中起主要作用的厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes)，这与黑叶猴采食树叶等食性相关[9]且与文献报道一致
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