崔小冬*，冯海先，潘俊英，赵双双，曹彩云
（呼和浩特市蒙医中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020）
摘要 目的：建立高效液相色谱法测定阿那日-5中胡椒碱含量的方法。方法：采用高效液相色谱法对阿那日-5中的胡椒碱进行含量测定。色谱条件为：采用C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温40℃，以甲醇-水（61:39）为流动相，检测波长343nm，流速1.0ml/min，进样量10μl。结果：色谱峰分离情况良好，胡椒碱在0.99μg/ml～29.67μg/ml范围内线性关系良好（r=0.9999）；平均加样回收率为97.56%，RSD=1.71%（n=9）。结论：本法建立的含量测定方法简便、准确、稳定、可靠，可用于阿那日-5的胡椒碱含量测定。
关键词 阿那日-5；高效液相色谱法；胡椒碱
To determinate the content of Piperine in Anari-5 by HPLC
Cui Xiaodong*, Feng Haixian, Pan Junying, Zhao Shuangshuang, Cao Caiyun
(Hohhot mengyizhongyi hospital, Hohhot, Inner Mongolia 010020)
Abstract: Objective: To establish an HPLC method for the determination of piperine in anari-5. Methods: The content of piperine in anari-5 was determined by HPLC and the chromatographic conditions were: C18 column (250mm×4.6mm,5μm), The column temperature was 40℃, the mobile phase was methanol-water (61:39), the detection wavelength was 343 nm, the flow rate was 1.0 ml/min, and the injection volume was 10μ1. Results: There were established a good linear relation between 0.99 μg/ml～29.67 μg/ml of Piperine, r=0.9999, the average recovery was 97.56%, RSD was 1.71%(n=9). Conclusion: The method is simple, accurate, stable and reliable, and can be used for the determination of piperine in anari-5.
Key words: Anari-5; HPLC; Piperine
阿那日-5是由石榴、肉桂、砂仁、荜茇、干姜五味药材组成。具有温胃、消食的功能，用于胃脘寒痛，消化不良，肾寒腰疼[1]。因该制剂无定量测定的含测方法，质量控制方面受到一定限制，为了提高和完善该制剂的质量标准，本试验参考比较2020年版《中国药典》中荜茇相关含量测定方法[2]以及《内蒙古蒙药制剂规范》2007年版[3]、《内蒙古蒙药制剂规范》2014年版[4]中胡椒碱的含量测定方法，建立了测定胡椒碱的高效液相色谱法。该方法简便、准确、稳定、可靠，为该制剂品种的质量控制提供依据。
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技(中国)有限公司）
QUINTIX35-1CN电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.2试剂
甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水
1.3试药
胡椒碱对照品（批号110775-201706；纯度98.9%）购于中国食品药品检定研究院；阿那日-5（20210104、20210105、20210106）由呼和浩特市蒙医中医医院制剂室提供。阴性样品（自制）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（61:39）为流动相；检测波长为343nm，柱温40℃。理论板数按胡椒碱峰计算，应不低于3000。
2.2 溶液制备
对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品适量，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品0.2g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加无水乙醇40ml，超声处理（功率120W，频率40kHz）30分钟，放至室温后，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性对照溶液的制备 取阴性样品（缺荜茇）适量，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。
2.3 测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
取4mg胡椒碱对照品，精密称定，转入100ml棕色容量瓶，加无水乙醇至刻度线摇匀，制成39.56μg/ml的对照品溶液。分别用移液器精密吸取0.25ml、1.25ml、2.50ml、5.00ml、7.50ml转入10ml容量瓶，加溶剂至刻度，分别稀释成0.99μg/ml、4.95μg/ml、9.89μg/ml、19.78μg/ml、29.67μg/ml的对照品溶液。各吸取10μl注入高效液相色谱仪中。以峰面积对浓度进行回归分析，结果显示胡椒碱在0.99μg/ml～29.67μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为y=62.33x-2.0563，（r=0.9999，n=5）。结果见表1。
表1 胡椒碱的标准曲线相关数据
Tab .1 Standard curve data of piperine
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2.3.2 精密度试验
取2.2项下的胡椒碱对照品溶液，按照2.1项下的色谱条件连续进样6针，进样量10μl，其峰面积的平均值为1245.8，RSD为0.11%。说明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验
取同一批号样品（批号20210104）供试品溶液，在0h，2h，4h，6h，8h，18h的时间点按照2.1项下条件进行测定，结果见表2。胡椒碱的峰面积积分值的RSD值为0.64%，表明供试品溶液在18小时内稳定。
表2 不同时间测定样品中胡椒碱的峰面积积分值
Tab. 2 The peak area integral value of piperine in sample at different times
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2.3.4 重复性试验
取同一批号样品（批号20210104）6份，每份各取约0.2g，按照“2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行含量测定，胡椒碱含量的RSD值为1.51%，结果见表3。
表3 重复性试验含量测定结果
Tab 3 Content determination results of repeatability test
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结果表明：供试品中指标性成分含量RSD值小于2.0%，重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验
精密称定供试品（批号20210104）9份，每份约0.2g，分别置于9个50ml棕色容量瓶中并分成三组。每组分别用移液器加入胡椒碱对照品溶液（39.56μg/ml）6.07ml，12.13ml，18.20ml，（约相当于供试品含量的50%，100%，150%），再加入无水乙醇至刻度。照2.2项下的方法处理后各10μl注入高效液相色谱仪中。得胡椒碱的平均回收率为97.56%，RSD为1.71%，结果见表4。
表4 加样回收率测定结果
Tab. 4 Recovery rate of the method
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结果表明：供试品中指标性成分回收率在95%以上，RSD值小于2.0%，表明方法准确度较好[5]。
3 样品含量测定
对三批样品按拟定的含量测定方法进行测定，按外标法计算胡椒碱成分的含量，结果见表5。对照品、阿那日-5样品、阴性样品测定色谱图见图1。
表5 样品测定结果
Tab. 5 Content determination results of samples
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根据以上三批阿那日-5测定，样品中胡椒碱最低含量在2.6mg/g以上。样品所用荜茇药材中胡椒碱含量为43mg/g（4.3%），计算胡椒碱在该制剂中的转移率为45.61%，由于2020版《中国药典》一部“荜茇”药材中胡椒碱的限度为不得少于2.5%，按该限度折算样品中胡椒碱的理论含量不低于1.5mg/g（按100%出成率计算），结合转移率再下调10%[6]，因此暂定本品每1g含荜茇以胡椒碱（C17H19NO3）计，不得少于1.4mg。
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图1 阿那日-5高效液相相关图片
A：胡椒碱对照品；B：阿那日-5样品；C：阴性样品
Fig.1 HPLC related pictures of anari-5
A: Piperine reference substance; B: Anari-5 samples; C: Negative samples
4 讨论
通过比较《中国药典》2020年版一部“荜茇”项下、《内蒙古蒙药制剂规范》2014年版查干高雅-14散项下及《内蒙古蒙药制剂规范》2007年版奥琪-11散项下胡椒碱的含测方法，胡椒碱检测波长均为343nm，因而沿用，而测定对照品及样品比较后最终确定流动相条件为甲醇-水（61:39），该条件下目标峰与其他成分达到较好的分离效果，峰形较好，保留时间适宜。胡椒碱溶液在光照下会发生分解，因而采取避光条件，在操作中使用棕色量瓶，有利于胡椒碱的稳定和保存，保证含测结果的准确。
5 结论
采用高效液相色谱法测定阿那日-5中胡椒碱的含量，结果分离度良好。本法建立的含量测定方法简便、准确、稳定、可靠，可用于阿那日-5的胡椒碱含量测定。
参考文献
[1] 卫生部药典委员会编．《中华人民共和国卫生部药品标准》蒙药分册1998年版[S] 北京：中国医药科技出版社，118.
[2] 国家药典委员会编．《中国药典》（一部）2020年版[S]．北京：中国医药科技出版社，246.
[3] 王伟 主编：康双龙，林燕，张丽娟副主编．内蒙古蒙药制剂规范[S]．呼和浩特：内蒙古人民出版社 2007：149-150．
[4] 王伟、高磊 主编：刘文茹，康双龙，林燕副主编．内蒙古蒙药制剂规范[S]．呼和浩特：内蒙古人民出版社 2014：195．
[5] 国家药典委员会编．《中国药典》（四部）2020年版[S]．北京：中国医药科技出版社，480-483.
[6] 内蒙古自治区食品药品监督管理局．内蒙古蒙药制剂规范注释（2007版第一 册下）[S]．内蒙古：内蒙古出版集团，2007：39-45.
第一作者：崔小冬（1983～），男，硕士，药检室负责人，从事制剂质量标准研究。
*通讯作者：崔小冬（1983～），男，硕士，药检室负责人，从事制剂质量标准研究。