1、傅超婷 、2、陈海刚
海南通用三洋药业有限公司 570312
甘磷酸胆碱是一种半合成的磷脂酰胆碱衍生物，被称为新型的胆碱能药物。甘磷酸胆碱除了在磷脂合成方面起作用以外，还能促进大脑乙酰胆碱的合成和释放，对轻中度的阿尔茨海默症有较好的治疗作用，也适用于缺血性脑卒中恢复期、短暂性脑缺血发作患者，改善所致的血管性认知功能障碍（VCI）。本品1990年首次在意大利上市销售，我国尚无批准上市，目前国内外关于甘磷酸胆碱软胶囊的质量评价研究少，甘磷酸胆碱为液体，水溶性好，口服软胶囊进入胃肠道能快速崩解溶出，被人体吸收，达到有效血药浓度而显效，避免了使用长期注射剂给患者带来的诸多不便。本文参考中国药典2010年版二部附录V D，采用高效液相色谱法建立甘磷酸胆碱软胶囊有关物质检测方法，对本品已知杂质氯化胆碱，甘油磷脂酰肌醇，甘油磷脂酰乙醇胺和未知杂质的检查方法进行研究，为国内甘磷酸胆碱软胶囊开发的质量研究提供一定的参考。
一、仪器与试剂
（1）仪器：
岛津高效液相色谱仪：
LC-10ATvp泵
CBM-20A控制器
CTO-10ASvp柱温箱
CLASS-VP色谱工作站
蒸发光散射检测器 ALLTECH ELSD 2000ES
色谱柱：CAPCELL PAK SCX柱?(250mm4.6mm,5m)
（2） 试剂：
乙腈（色谱纯） MREDA TECHNOLOGY INC
甲酸铵（分析纯）国药集团化学试剂有限公司
甲酸（分析纯）北京化工厂
（3）样品
杂质对照品：氯化胆碱、甘油磷脂酰乙醇胺、甘油磷脂酰肌醇对照品均由意大利 Euticals SPA提供
甘磷酸胆碱对照品：来源：Sigma-Aldrich ；纯度：98.00%。
甘磷酸胆碱软胶囊：自制，批号：110701、110801、110802、110803。
甘磷酸胆碱软胶囊市售品：批号11108，意大利ITALFARMACO S.p.A公司
二、方法建立
（1）检测器选择
取甘磷酸胆碱原料，氯化胆碱对照品，甘油磷脂酰乙醇胺对照品和甘油磷脂酰肌醇对照品适量,分别加水制成每1ml含1mg的溶液，照紫外分光光度法（中国药典2010年版二部附录IV A）在200～400nm范围内进行紫外光谱图扫描，试验结果见表1。
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紫外扫描结果表明,甘磷酸胆碱及其已知杂质在200～400nm范围内无吸收,不能使用紫外检测器检测,故选用蒸发光散射检测器进行检测。
(2)色谱条件建立试验
拟采用阳离子交换色谱柱对样品和已知杂质氯化胆碱,甘油磷脂酰肌醇、甘油磷脂酰乙醇胺进行分离。
精密称取甘磷酸胆碱对照品适量，置容量瓶中，加水溶解制成浓度约为50mg/ml的溶液，作为供试溶液。以乙腈-0.001M 甲酸铵（99:1），用甲酸调pH至3.0为流动相A，乙腈-0.04M 甲酸铵（60:40），用甲酸调pH至5.0为流动相B，采用PAK-SCX阳离子交换柱进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为
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流速为1.0ml/min，柱温30℃，用蒸发光散射检测器检测（漂移管温度80℃, 载气流速为2.0L/min），精密量取供试溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。在该色谱条件下，主峰保留时间为58.100min，峰形较好。
精密称取甘磷酸胆碱、氯化胆碱、甘油磷脂酰乙醇胺、甘油磷脂酰肌醇、胶囊壳和内容物甘油适量，加水溶解并配制成每1ml中分别约含50mg，0.25mg，0.25mg，0.25mg、50mg和3mg的混合溶液，摇匀，滤过，作为混合供试溶液；精密量取混合溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图主峰（保留时间为58.017）与其相邻杂质分离度为0.84，小于1.5，不符合要求，需优化色谱条件。
（3）色谱条件优化
在“色谱条件建立试验”基础上，调节梯度洗脱程序为：
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精密量取混合供试溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果，在该色谱条件下，甘磷酸胆碱主峰保留时间在65.092分钟，峰形较好，甘磷酸胆碱与其相邻的杂质峰分离度均大于1.5。取甘磷酸胆碱、氯化胆碱、甘油磷脂酰乙醇胺、甘油磷脂酰肌醇、空胶囊壳和空白辅料（甘油）适量，分别置容量瓶中，加水溶解，配制成各自的定位溶液。甘磷酸胆碱、氯化胆碱、甘油磷脂酰乙醇胺、甘油磷脂酰肌醇、空胶囊壳和辅料（甘油）的定位溶液浓度分别约为50mg/ml，0.25mg/ml，0.25mg/ml，0.25mg/ml、50mg/ml和3mg/ml。取各定位溶液20ul注入液相色谱仪，记录色谱图，各峰保留时间如下表2：
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除甘油磷脂酰乙醇胺外，其他杂质峰与辅料峰、主峰与相邻杂质峰的分离度均大于1.5，以甘磷酸胆碱主峰计，理论板数大于10000。
研究中发现不同批号的甘油色谱图会有差异，在分析方法验证过程中用到的甘油在上述的色谱条件下，色谱图中无色谱峰出现。
综上所述，优化后的色谱条件除甘油磷脂酰乙醇胺外，其他已知杂质、辅料及主峰之间均能完全分离，主峰与相邻杂质也能完全分离，因此确定采用本方法进行甘磷酸胆碱软胶囊已知杂质氯化胆碱，甘油磷脂酰肌醇和未知杂质的检查。甘油磷脂酰乙醇胺需另外建立方法对其进行检查。
（4）确定的色谱条件
流动相为A:乙腈-0.001M 甲酸铵（99:1），用甲酸调pH至3.0；B:乙腈-0.04M 甲酸铵（60:40），用甲酸调pH至5.0,采用梯度洗脱程序:
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流速为1.0ml/min，柱温30℃,用蒸发光散射检测器检测（漂移管温度80℃, 载气流速为2.0L/min）。
（5）系统适用性及相对保留时间的确定
精密称取甘磷酸胆碱，氯化胆碱,甘油磷脂酰肌醇、空胶囊壳和甘油适量，加水溶解并配制成每1ml中分别约含50mg，0.25mg， 0.25mg、50mg和3mg的混合溶液，摇匀，滤过，作为系统适用性溶液。精密量取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。结果甘磷酸胆碱与其相邻各杂质分离度良好，已知杂质与其相邻峰分离度良好。见表3，甘磷酸胆碱与已知杂质相对保留时间见表4。
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（6）测定法
取内容物适量（约相当于甘磷酸胆碱500mg），精密称定，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液；取供试品溶液1ml, 置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取对照溶液20ul注入液相色谱仪，调节灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如有相对保留时间为0.83（甘油磷脂酰肌醇）和1.1（氯化胆碱）的杂质峰，其各峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），除辅料峰，其他单个杂质的峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍（0.2%）,各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的两倍（2.0%）。
(7) 降解试验
1.未降解样品：称取本品内容物适量（约相当于甘磷酸胆碱500mg），置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为未破坏样品溶液
2. 酸降解试验：称取本品内容物适量（约相当于甘磷酸胆碱500mg），置10ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液2ml，40℃水浴放置1小时，用1mol/L氢氧化钠溶液中和, 加水溶解并定容。摇匀，滤过，取续滤液。同法制得酸降解空白辅料溶液。
3. 碱降解试验：称取本品内容物适量（约相当于甘磷酸胆碱500mg），置10ml量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液2ml，40℃水浴放置30分钟，用1mol/L盐酸溶液中和, 加水溶解并定容。摇匀，滤过，取续滤液。同法制得碱降解空白辅料溶液。
4. 氧化降解试验：称取本品内容物适量（约相当于甘磷酸胆碱500mg），置10ml量瓶中，加30%双氧水4ml，60℃水浴放置4小时，加水溶解并定容。摇匀，滤过，取续滤液。同法制得氧化降解空白辅料溶液。
5. 高温降解试验：称取本品内容物适量（约相当于甘磷酸胆碱软胶囊500mg），置10ml量瓶中，在105℃条件下放置36小时，加水溶解并定容。摇匀，滤过，取续滤液。同法制得高温降解空白辅料溶液。
6. 光照降解试验：称取本品内容物适量（约相当于甘磷酸胆碱500mg），置10ml量瓶中，在4500LX灯光照下放置12小时，加水溶解并定容。摇匀，滤过，取续滤液。同法制得光照降解空白辅料溶液。
分别取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，结果见表5。
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由上表结果可见，本品在强碱、强酸、氧化、高温、光照条件下均有降解物产生，本品对强碱、强酸、光照相对更敏感。强碱、强酸、高温、氧化与光照破坏样品色谱图中降解出的杂质，均与主峰分离良好 。
因配制的空白辅料使用的甘油不出峰，故空白辅料各条件下的破坏色谱图中均未出现22分钟左右的辅料峰。
（8）耐用性试验
精密取“系统适用性”项下混合溶液20μl，注入液相色谱仪，考察本色谱条件在不同柱温和不同流速下各色谱峰的分离度,结果表明：柱温在20℃～30℃，流速范围在0.95～1.05ml/min时，主峰与杂质峰，辅料峰与杂质峰的分离度均符合规定。
（9）检测限
取甘磷酸胆碱适量加水配制一系列浓度的溶液，用试验测得的信噪比为3：1的溶液计算其检测限，连续进样3针，结果甘磷酸胆碱的最小检测量为0.2ug。
（10）有关物质样品溶液稳定性试验
取本品内容物适量，加水溶解并制成每1ml约含甘磷酸胆碱50mg的溶液，室温放置，分别于0、2、4、8小时进样，其结果见表10-26，色谱图见图10.5.3-36～10.5.3-39。
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结论：有关物质样品溶液室温放置8小时内基本稳定。
结论：由三批自制品与市售品有关物质检查对比表可以看出，自制品与市售品均检出2个未知杂质，未知杂质的量无明显差异。由保留时间判断，自制品与市售品检出的是相同的未知杂质。本品三批样品与市售品的氯化胆碱，甘油磷脂酰肌醇均未检出，未知杂质均小于0.2%，总杂质均小于2.0%。
四、结论
采用本高效液相色谱方法对已知杂质氯化胆碱,甘油磷脂酰肌醇及有关物质进行检查。经方法验证，辅料不干扰杂质的检查，甘磷酸胆碱软胶囊在光照、酸、碱、氧化、高温条件下的各降解产物与主峰均分离良好。供试品溶液在室温8小时内稳定，耐用性、检测限均符合要求，本方法可用于甘磷酸胆碱软教囊有关物质的测定，为国内甘磷酸胆碱软胶囊开发的质量研究提供一定的参考。
参考文献
1、中国药典2010版二部附录