刘伟乐 郑少伟通讯作者 曾国威 孙春汉 温志嘉 钟浩博
（惠州市第一人民医院骨科；广东惠州516000）
【摘要】 目的 研究micro-RNA-708-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的作用及机制。方法 正常细胞hMSC作为对照组，骨肉瘤细胞株MG63作为实验组。比较不同组细胞micro-RNA-708-5p水平及细胞增殖、凋亡。结果骨肉瘤细胞株MG63中micro-R NA-708-5p水平显著低于正常细胞hMSC（P＜0.05）；转染micro-RNA-708-5p组MG63细胞凋亡率显著增高，而增殖活性显著降低（P＜0.05）；经micro-RNA-708-5p转染后 ZEB1荧光素酶活性显著下调（P<0.05）；ZEB1在骨肉瘤细胞株MG63中表达更高（P＜0.05）；Transwell小室法观察下调ZEB1显著抑制MG63细胞迁移能力；micro-RN A-708-5p转染组MG63细胞中ZEB1蛋白含量表达相对降低。 结论 micro-RNA-708-5p可抑制细胞增殖，诱导骨肉瘤细胞凋亡，作用机制可能与靶向作用ZEB1抑制MG63细胞迁移有关。
【关键词】micro-RNA-708-5p；骨肉瘤细胞；作用机制
The effect of micro-RNA-708-5p on the proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells and its mechanism
LIU Weile，ZHENG Shaowei，ZENG Guowei，SUN Chunhan，WEN Zhijia
Huizhou First Hospital，Huizhou 516000，Guangdong China
[Abstract] Objective To study the effect of micro-RNA-708-5p on the proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells and its mechanism.Method Normal cells hMSC were used as the control group, and the osteosarcoma cell line MG63 was used as the experimental group.The levels of micro-RNA-708-5p and cell proliferation and apoptosis of different groups were compared. Result The level of micro-R NA-708-5p in the osteosarcoma cell line MG63 was significantly lower than that of normal cells hMSC (P＜0.05).The apoptotic rate of MG63 cells in the micro-RNA-708-5p group significantly increased, while the proliferation activity significantly decreased (P＜0.05).After micro-RNA-708-5p transfection, the activity of ZEB1 luciferase decreased significantly (P<0.05). The expression of ZEB1 in the osteosarcoma cell line MG63 was higher (P<0.05). Transwell cell method showed the downregulation of ZEB1 can significantly inhibit the migration ability of MG63 cells. The expression of ZEB1 protein in MG63 cells in the micro-RNA-708-5p transfection group relatively was lower. Conclusion micro-RNA-708-5p can inhibit cell proliferation and induce apoptosis of osteosarcoma cells. The mechanism of action may be related to the targeting effect of ZEB1 on inhibiting MG63 cell migration.
[Keywords] Micro-RNA-708-5p; Osteosarcoma cells; Mechanism of action
MicroRNA是近年来新发现的非编码RNA小分子核苷酸，广泛存在于真核生物；与细胞增殖、侵袭、分化和凋亡密切相关[1]。其中，MicroRNA134及MicroRNA26a与骨肉瘤增殖及血管生成关系密切；MicroRNA454可抑制骨肉瘤细胞侵袭；而大量研究在非小细胞肺癌、乳腺癌及肾癌细胞研究发现，micro-RNA-708-5p可抑制癌症细胞转移，诱导癌症细胞凋亡并抑制其肿瘤发生[2]。故此，本研究对骨肉瘤患者作为研究对象，分析micro-RNA-708-5p对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的作用及机制，为临床应用治疗提供新的方法、思路及依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
细胞标本来源收集及制备 3例男性健康志愿者中获得骨髓（5-7ml）。人骨肉瘤细胞株MG63、、HEK 293T细胞购自美国模式培养物集存(American Type Culture Collection, ATCC)，保存于重庆医科大学临床检验诊断学实验室。
1.1.2 实验分组
正常细胞hMSC作为对照组，骨肉瘤细胞株MG63作为实验组。细胞转染：将MG63细胞接种于6孔板中，置于37℃、5%CO２的培养箱中培养至细胞密度60％~70％之后培养基换成每孔1mL无血清无双抗的培养基；micro-RNA-708-5p转染试剂Lipofectamine 2000 分别用100μＬOMEM稀释后，依照说明书所需比例混匀后静置20ｍin，逐滴加入并且轻晃混匀，培养６ｈ后；再换为含完全培养基，待48h后收集细胞进行下一步分析。
1.2 检测方法
1.2.1 采用qPCR 检测正常细胞hMSC、骨肉瘤细胞株MG63水平（通过逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。设计正常细胞hMSC、骨肉瘤细胞MG63引物，按照qPCR试剂盒说明书配置反应体系，设定反应条件，上机检测）。通过Targe tScan法及荧光素酶报告基因预测并观察micro-RNA-708-5p与ZEB1的靶向关系。
1.2.2 采用CCK-8 检测MG63细胞活性增殖情况（将MG63细胞接种至96孔板。转染处理后48h，37℃孵育30min，酶标仪酶标仪检测450nm处的OD值来评估细胞增殖活力）。
1.2.3 采用Annexin-FITC/PI 双染法流式细胞术检测细胞凋亡（细胞经转染处理后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤。通过细胞凋亡试剂盒进行检测。细胞加入5 μl Annexin V-FITC和5μl PI试剂室温避光孵育30min，通过流式细胞仪进行检测）。
1.3观察指标
（1）比较正常细胞hMSC组、骨肉瘤细胞株MG63组micro-RNA-708-5p 水平
（2）分析micro-RNA-708-5p与ZEB1的靶向关系
（3）转染micro-RNA-708-5p对MG63细胞增殖、凋亡的影响
1.4 统计学分析
采用SPSS18.0系统软件对本研究所有数据进行分析计量资料以均数±标准差（±S）表示，采用重复测量分析，t检验或方差分析；计数资料通过百分比或率表示，采用χ2检验0.05表示有统计学意义。
2. 结果
2.1 正常细胞hMSC组、骨肉瘤细胞株MG63组micro-RNA-708-5p 水平比较
如图1所示，micro-RNA-708-5p水平在正常细胞hMSC组中呈高表达状态，在骨肉瘤细胞株MG63组中呈低表达状态（P＜0.05）。
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图1 正常细胞hMSC组、骨肉瘤细胞株MG63micro-RNA-708-5p水平
2.2 分析micro-RNA-708-5p与ZEB1的靶向关系
经micro-RNA-708-5p转染后 ZEB1荧光素酶活性显著下调（P< 0.05）。见表1。经qPCR显示，ZEB1在骨肉瘤细胞株MG63组较正常细胞hMSC组呈高表达状态（P＜0.05），见图2；而通过siRNA敲低ZEB1，予以Transwell小室法观测细胞的迁移能力发现，下调ZEB1可以显著抑制MG63的迁移能力；见图3、图4。经Western blot实验显示：micro-RNA-708-5p转染组MG63细胞中ZEB1蛋白含量表达相对降低，见图5。
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3 讨论
据流行病学统计，18%左右的骨肉瘤患者在就诊时已出现转移性骨肉瘤情况，其预后极差，生存率仅为30%，严重威胁患者的生命安危[3]。目前，临床对于其治疗方式主要以化疗联合手术切除病灶为主，但由于耐药和转移情况，该疾病的治疗及预后仍不理想。故如何寻找新的治疗靶点成为了临床的研究重点[4]。
MiRNA是一段约由19~25个核苷酸组成的非编码小RNA，通过对其靶mRNA的翻译抑制或者降解在动、植物体内发挥重要的调节作用[5]。目前，micro-RNA-708-5p已被证实在乳腺癌、肾癌、非小细胞癌等多种癌症转移及预后中密切相关。同时，相关研究表示， 骨肉瘤的肿瘤起始细胞可能是在特定的骨微环境中发育的间充质干细胞(MSC)[6] 。本研究显示，micro-RNA-708-5p水平较正常细胞hMSC组在骨肉瘤细胞株MG63组中呈低表达状态；而经转染micro-RNA-708-5p 后MG63细胞凋亡率显著增高，而增殖率显著降低（P＜0.05），由此表明：micro-RNA-708-5p与MG63细胞增殖、凋亡密切相关。另本研究发现，转染micro-RNA-708-5p转染后ZEB1荧光素酶活性显著下调，说明，micro-RNA-708-5p可与ZEB1进行靶向结合产生生物学作用。考虑其原因与通过下调E-cadherin来诱导上皮–间质转化，使细胞极性丧失，基底膜结构改变和重构，并增加细胞迁移、侵袭从而加快恶性肿瘤的进展[7]。而通过qPCR检测显示，ZEB1在骨肉瘤细胞株MG63组呈高表达状态，故此，进一步将siRNA敲低ZEB1研究发现，下调ZEB1后MG63可明显受到抑制，同时micro-RNA-708-5p转染组MG63细胞ZEB1蛋白含量表达降低，考虑与miR-708-5p与ZEB1靶向结合抑制MG63细胞增殖及骨肉瘤细胞迁移，诱导骨肉瘤细胞凋亡有关。
综上所述，micro-RNA-708-5p可抑制细胞增殖，诱导骨肉瘤细胞凋亡，作用机制可能与靶向作用ZEB1抑制MG63细胞迁移有关。
参考文献
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[4]丁帅, 张广泉, 高延征,等. 微小RNA-181对骨肉瘤细胞增殖、凋亡的影响及分子机制[J]. 中华实验外科杂志, 2018, 35(001):29-31..
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[6]吐尔洪·吐尔逊, 塔依尔江·亚生, 艾尔肯·阿木冬. 微小RNA-499-5p对骨肉瘤细胞增殖能力的影响[J]. 中华实验外科杂志, 2018, 35(1):38-40.
[7]丰天宇, 朱中凯, 王豪,等. microRNA-708-5p对骨肉瘤细胞凋亡与迁移的作用及机制[J]. 中国细胞生物学学报, 2019, 41(03):446-455.
【基金项目】广东省中医药局科研项目（20202215）；惠州市科技局（2020Y049）；惠州市科技局（2012Y053）；惠州市科技局（2015B040010004，2017惠州市第一人民医院科研培育与创新基金项目）；广东省医学科研基金B2012373