刘颖芳， 黎 冠
（珠海天祥粤澳质量技术服务有限公司，广东 珠海，519000）
摘要：研究建立了化妆品中视黄醇及其衍生物含量的高效液相(HPLC)方法。化妆品样品用甲醇提取视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯，以Agilent poroshell EC C18色谱分离柱，甲醇洗脱，使用二极管阵列检测器测定，以校准曲线法进行定量。所建立的高效液相色谱法(HPLC)对于分析化妆品中视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯的批内、批间RSD分别为1.32%～2.83%、0.73%～3.43%，回收率为92.1%～102.7%。
关键词：化妆品；视黄醇；高效液相色谱法
维生素A，又称视黄醇，是一种脂溶性化合物，耐高温，在空气中易氧化。维生素A用于化妆品原料时，包括视黄醇及视黄醇酯类衍生物等，目前的学术研究表明，维生素A对于治疗皱纹，增加表皮厚度有很好的功效[1]。由于维生素A在抗皱、抗衰老及改善皮肤弹性方面的优良功效，越来越多的化妆品公司都在生产自己的视黄醇产品及申请相关产品的专利[2-4]。加拿大Hotlist中，维生素A在化妆品中的最大允许使用量为1.0%（视黄醇当量）。2012年，欧洲化妆品协会提交了一份安全档案，以支持化妆品中维生素A的继续使用。2016年欧洲消费者科学委员会（SCCS）通过了对维生素A（视黄醇、棕榈酸视黄酯和视黄醇醋酸酯）的最终定稿，SCCS认为维生素A作为化妆品成分是安全的。其在身体乳液的最大使用浓度为0.5%（视黄醇当量）；在手霜、面霜及淋洗类产品中的最大使用浓度为0.3%（视黄醇当量）。中国《化妆品安全技术规范》（2015版）并未对维生素A在化妆品中的最大使用浓度有所规定。由于维生素A化学性质活泼，不稳定，大部分化妆品生产商会添加视黄醇醋酸酯、视黄醇丙酸酯及视黄醇棕榈酸酯，视黄醇酯类物质会在人体的真皮层转化为维生素A，从而来达到化妆品抗皱、抗衰老及改善皮肤弹性方面的功效。
目前对于维生素A的检验方法大部分集中在食品、饲料[5-6]领域，尚无化妆品中维生素A的检验方法。由于维生素A为脂溶性化合物，一般添加于膏霜乳液产品。本文结合膏霜乳液化妆品的特性，以GB 1903.31-2018 为参考，选择一种简单的样品提取方法，提高待测组分在前处理过程中提取效率，最终建立了一种快速、准确、灵敏度高、分离度好的高效液相色谱检测方法。
1. 实验部分
1.1仪器与试剂
Ultimate 3000 HPLC 双三元高效液相色谱，美国Thermo Fisher；甲醇、乙醇，高效液相色谱级；氯化钠，分析纯；高纯水，Milli-pore处理。化妆品样品：市售眼霜。视黄醇标准物质：纯度99.3%，不确定度0.5%；醋酸视黄醇标准物质：纯度97.9%，不确定度0.8%；丙酸视黄醇标准物质：纯度90.%；棕榈酸视黄醇标准物质：纯度98.2%，不确定度0.5%。
1.2校准贮备液及校准曲线溶液的配制
配制视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄醇丙酸酯及视黄醇棕榈酸酯/甲醇贮备液（均为约1mg/g），-18℃保存。用甲醇稀释至约5、10、20、50、100mg/kg，配置各浓度混合校准溶液，4℃保存，可使用2个月。
1.3样品前处理
称取1.0g添加视黄醇及其衍生物的眼霜样品于10mL容量瓶，加入0.5g氯化钠，再加入5mL甲醇，涡旋振荡3min，涡旋振荡使样品与提取溶剂充分混匀，用甲醇稀释至刻度。混匀后，转移至10mL离心管，以5000r/min离心5min，取上清液用0.45μm的有机相滤膜过滤至2mL样品瓶中，进行分析。
1.4色谱条件
色谱柱Agilent poroshell EC C18 4.6×100mm，2.7μm；流动相：100%甲醇；柱温：35℃；流速梯度洗脱程序:0→4min，0.8mL/min；4→8min，3.0mL/min；8→10min，0.8mL/min。DAD检测器的检测波长为325nm。样品进样量10μL。
1.5仪器测量和数据处理
先测定校准曲线从低到高的混合校准溶液，通过不同浓度下所得到的色谱响应峰面积对该浓度作图，得到校准曲线，再对所测样品根据浓度从低到高进行测定，将各浓度化妆品样品测得的响应峰面积带入校准曲线方程，计算出样品溶液的浓度，从而得到化妆品样品中视黄醇及其衍生物的浓度。
2. 结果
2.1样品提取效率和色谱分离
膏霜乳液样品基质中脂溶性成分多且复杂，为了其他脂溶性组分的干扰，我们考查了样品中视黄醇及其衍生物提取所用的提取液的选择。比较了两个条件：（1）提取用有机溶剂，甲醇或者乙醇；（2）是否添加氯化钠。实验中发现，添加氯化钠能使提取液更加澄清，减少乳化现象；使用甲醇提取液可以视黄醇及其衍生物各出峰位置附近更干净。样品色谱图见图1。
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图1：眼霜中视黄醇及其衍生物的色谱图
Fig.1：Chromatograms for tetracyclines from a sea perch sample
2.2精密度
为考察方法的精密度，测定3种不同加标的眼霜样品，每种浓度每个批次平行测定3份，共测定3批，结果总结于表1。可见该方法具有很好的精密度，其RSD值均小于3.5%。
表1： HPLC测定眼霜中视黄醇及其衍生物的精密度
Tab.1 Analytical results of retinol and its derivatives in eye cream with LC/MS/MS
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2.3回收率
以市售眼霜为空白样，分别加入一定量的已知浓度视黄醇及其衍生物混合溶液，形成低（均约50mg/kg）中（均约100mg/kg）高（均约500mg/kg）3个浓度。将空白与低中高共4组眼霜样品按前述方法进行处理和测量，各浓度回收率如表2所示。
表2： HPLC测定眼霜中视黄醇及其衍生物的回收率
Tab.2 Recovery of retinol and its derivatives in eye cream with HPLC
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2.4线性范围和检测限
实验结果表明眼霜中视黄醇及其衍生物浓度在0.05~1g/kg范围内线性关系良好，相关系数r为0.9998-0.9999。在视黄醇及其衍生物浓度浓度为5～100mg/kg时，视黄醇及其衍生物浓度（x）与其对应峰面积（y）比呈良好的线性关系（见图2），以3倍信噪比作为检出限(LOD)，计算检出限分别为：视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄醇丙酸酯为5mg/kg；视黄醇棕榈酸酯为10mg/kg。
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图2：视黄醇及其衍生物峰面积（y）对浓度（x）的校准曲线
Fig.2：The calibration curve y for the peak area while x for the
2.5测量方法的不确定度
影响眼霜中视黄醇及其衍生物含量测量结果的因素，主要有测量过程的随机因素和系统因素，包括测量的变动、天平称量、校准物的纯度，校准溶液体积等因素，产生的不确定度分为A类和B类不确定度。具体见表3所示。
表3：眼霜中视黄醇及其衍生物不确定度评估
Tab.3 Estimation of uncertainties for HPLC measurements of retinol and its derivatives in eye cream
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3 讨论
本文建立了高效液相色谱法测定化妆品中视黄醇及其衍生物的分析方法，前处理简单、快速、目标物提取率高，在视黄醇及其衍生物添加含量范围内具有良好的准确度和精密度，干扰低，为常规实验室提供眼霜中视黄醇及其衍生物测量的参考。
参考文献：
[1]Volker Schehlmann. COMPOSITION COMPRISING AN HDAC INHIBITOR IN COMBINATION WITH A RETINOID[J]. 2014.
[2]钱进, 向琼彪, 黄建珍,等. 一种视黄醇包裹物和抗衰祛皱精华液及其制备方法:, 2020.
[3]赵冰怡, 丛琳, 李雪竹. 一种具有抗初老功效的组合物及其在化妆品中的应用:, 2020.
[4]闫继鹏, 李雪竹, 丛琳. 一种改善皮肤弹性的抗衰老化妆品组合物:, 2020.
[5]中华人民共和国卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局.GB 5009.82-2016 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定[S].2017.
[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. GB/T 17817-2010 饲料中维生素A的测定 高效液相色谱法[S].2010.
Determination of retinol and its derivatives in cosmetics by HPLC
Liu Yingfang, Li Guan, Li Neng
(Intertek GM Testing Services Zhuhai Ltd., Guangdong Zhuhai, 519000)
Abstract: A measurement method for retinol and its derivatives in cosmetics involving HPLC has been developed. The retinol and its derivatives were extracted from cosmetics using methanol prior to reversed-phase HPLC-DAD determination. Separation was performed on a Agilent poroshell EC C18 column using gradient elution with methanol. An Agilent tandem mass spectrometer equipped with an electrospmy ionization source operated in multiple reaction monitoring(MRM) mode was utilized, and the results of determination were calculated from the calibration curve．The results of the HPLC method for the analysis of retinol, retinyl acetate, retinyl propionate, retinyl palmitate in cosmetics are as follows, the within-run RSD ranged from 1.32% to 2.83%, between-run RSD ranged from 0.73% to 3.43% and recoveries ranged between 92.1% and 102.7%.
Keywords: cosmetic; retinol; HPLC
[作者简介：刘颖芳(1986-)，女，湖南人，化工工程师，硕士。]